小麦基因型衡9966与亲本及近缘品种叶绿素组分分析

时丽冉，赵明辉，李会敏，乔文臣，孙书娈，孟祥海，李丁，李强，魏建伟，白丽容，赵凤梧*

（1.衡水学院，河北衡水053000；2.河北省农作物抗旱研究重点实验室，河北省农林科学院旱作农业研究所，河北衡水053000）

小麦基因型衡9966与亲本及近缘品种叶绿素组分分析

时丽冉1，赵明辉2，李会敏2，乔文臣2，孙书娈2，孟祥海2，李丁2，李强2，魏建伟2，白丽容1，赵凤梧2*

（1.衡水学院，河北衡水053000；2.河北省农作物抗旱研究重点实验室，河北省农林科学院旱作农业研究所，河北衡水053000）

从植物生理学角度，对小麦双亲和衍生后代以及亲本近缘品种叶绿素组分、比例和总含量进行分析，可为品种选育及知识产权保护提供依据。取越冬期冬小麦基因型衡9966及其亲本良星99和良星66以及亲本近缘品种济麦22的幼苗叶片，进行叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a＋b含量以及叶绿素a/b测定与显著性分析。结果表明：衡9966的叶绿素a含量、叶绿素b含量及其二者总量和比值均高于双亲本及济麦22，其中，叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a＋b含量差异达到了极显著水平；叶绿素a/b与双亲和双亲平均值差异达到了显著水平，但与济麦22无显著差异。衡9966叶绿素a含量分别较良星66、良星99、济麦22高57.89%、46.34%和17.65%，较高的叶绿素a含量导致其叶片颜色较深。叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素a＋b含量、叶绿素a/b这4个指标均具有明显的正向超亲现象，育种选择十分有效。叶绿素组分、比例及总含量可以作为检测品种真实性的手段和方法之一，用于知识产权保护。

小麦；亲本；叶绿素；品种保护

小麦是世界主要粮食作物之一，也是我国的三大粮食作物之一，世界上有35%的人口以小麦为主食。研究表明，不断选育和推广优良品种是提高小麦产量最经济有效的措施[1]。因此，小麦遗传多样性研究和品质改良显得越发突出，其对生物多样性的保护和生物资源的可持续利用都具有重要意义，因而受到了国内外学者的广泛重视[2]。知识产权保护是对创新成果的法律确认和有效保障[3]，其中，植物新品种保护事关国家农业基础地位的稳定，是农业和种业发展的焦点，也是农民可持续增收的有力支撑，在作物新品种审定与应用中起到越来越大的作用[4]。在品种审定中，比较试验指标[5]、DUS测试指标、DNA指纹检测[6]、转基因检测等一系列科学、严谨的评价标准势必会对品种的真实性检测、审定、开发、分类、管理、保护等产生重大影响，进一步规范我国种业的发展道路[7，8]，同时，还可为小麦遗传资源的收集、保存、分类、评价以及核心种质的建立等研究工作提供理论依据[9]。

鉴于遗传育种的进步与遗传背景差异、新品种的要求与资源创新进展要求、统计学方法应用在新品种DUS特异性判定等方面的作用日趋明显[10，11]，Eeuwijk等[12]提出了使用单元和多元统计方法来判定植物新品种的特异性，程海荣等[13]对水稻（Oryza sativa L.）申请品种及其近似品种测试性状的差异显著性判定进行了分析，为判定品种的特异性提供了依据；徐振江等[14]则针对水稻申请品种数量性状倒二叶叶舌长度、茎秆长度、茎秆粗细、剑叶叶片长度、剑叶叶片宽度、穗长、每穗粒数、谷粒长、谷粒宽、谷粒长宽比DUS田间测试，利用t显著性统计分析方法判别特异性，指出统计分析判别是除指南判别外的重要判别依据。在测试性状的筛选和判定方面，我国学者利用变异系数、t检验、系统聚类法等方法，分别对百合、唐菖蒲、菊花的DUS测试指南候选性状的一致性、稳定性进行了分析判定，进而筛选出可用于品种特异性判定的叶片颜色、茎颜色分布、花柱颜色、叶片宽度、株高等性状[15～18]。

叶绿体是小麦进行光合作用的场所，叶绿素是小麦叶绿体中参与光合途径最为重要的光合色素，其在光合作用的过程中扮演着重要角色[19]。叶绿素是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜，改良小麦叶绿素的遗传特性成为国内外学者的研究热点[20～23]。董连生[24]通过分子生物学与生理学结合的方法，对双亲及RILs群体等材料定位了2个控制小麦盛花期、灌浆期的叶绿素含量主效QTL，分别位于2AS和5AL上。

叶绿素吸收大部分的红光和紫光，但反射绿光，因此呈现绿色，其在光合作用的光吸收方面起核心作用。叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等[25]。其中，叶绿素a的最大吸收光波长为420～663 nm，叶绿素b的最大吸收波长范围为460～645 nm。在颜色上，叶绿素a呈蓝绿色，而叶绿素b呈黄绿色[26]。较高的叶绿素a含量和叶绿素a/b（叶绿素a含量/叶绿素b含量）与作物的抗逆性呈正相关[27～29]，与光合作用产物的多少有着非常密切的关系[30]，并均能影响小麦基因的一般配合力和特殊配合力[31]。但截至目前，采用上述生理指标即叶绿素含量、组分和荧光对后代以及亲本进行评判的研究尚未见报道。

衡9966是河北省农林科学院旱作农业研究所选育的一个小麦新品系，目前已参加河北省冀中南节水组生产试验。田间目测发现，衡9966与其亲本良星99和良星66以及亲本近缘品种济麦22（与良星99和良星66来源于共同亲本鲁麦14）的苗期叶片颜色存在较大差异，推测该现象与叶片的叶绿素组成即叶绿素a含量、叶绿素b含量及其比例有关。因此，对衡9966与其亲本以及亲本近缘品种济麦22苗期叶片的叶绿素组成指标进行了测定，分析了4个基因型小麦的差异，根据研究结果，作者提出可以将后代与亲本的叶绿素组分和比例作为检测品种真实性的手段和方法之一，用于知识产权保护。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试小麦基因型为衡9966，来源于河北省农林科学院旱作农业研究所小麦遗传育种课题组。其选育过程为：2009年配制杂交组合〔8099（良星99/小黑麦//良星99）/良星66），收获后对F0进行60Co辐射处理；2010年F1代选育，同时对收获种子再次进行辐射处理，以增加优良变异；2011～2016年后代系谱法选育。

亲本良星99和良星66，均来源于山东德州市良星种子研究所；亲本近缘品种济麦22，来源于山东省农业科学院作物研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 田间设计田间试验在河北省农林科学院旱作农业研究所节水试验站（东经115°42′、北纬37°44′，海拔31.7 m）进行。2016年10月6日造墒播种小麦，设衡9966、良星99、良星66和济麦22计4个基因型处理。小区面积11.48 m2（行长8.5 m，行距15 cm，9行/区），间比法排列，小麦种植顺序为良星66—衡9966—良星99—衡9966—济麦22，2次重复。小麦基本苗数量均为330万株/hm2，田间管理同常规。

1.2.2 测定项目与方法参考张宪政[32]的丙酮-乙醇混合液提取法，测定叶绿素含量。2017年2月15日，每品种均田间选取越冬期幼苗5株，带回室内；剪取整株叶片混合，用蒸馏水冲洗干净、吸水纸吸干，切成长1 cm的小段；准确称量0.2 g，放入具塞的试管中，加入丙酮和无水乙醇各10 mL，盖好塞子摇匀，在室温、黑暗条件下提取，直至叶片变白（约48 h）；然后，分别在663 nm和645 nm处测定吸光度。利用公式，计算叶绿素组分各指标值：

叶绿素a含量（mg/g）=（12.7A663-2.69A645）×提取液体积（L）/植物材料鲜重（g）

叶绿素b含量（mg/g）=（22.9 A645-4.68 A663）×提取液体积（L）/植物材料鲜重（g）

叶绿素a＋b含量（mg/g）=（8.02 A663+20.21 A645）×提取液体积（L）/植物材料鲜重（g）

叶绿素a/b=叶绿素a含量/叶绿素b含量

超亲优势（%）=（衡9966指标值-亲本指标值）/亲本指标值×100

双亲平均数（%）=（亲本1指标值+亲本2指标值）/2×100

超双亲优势（%）=（衡9966指标值-双亲指标值平均数）/双亲指标值平均数×100

1.2.3 数据分析利用DPSc数据处理系统，对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 参试小麦基因型的苗期叶片颜色

苗期田间目测结果（图1）显示，衡9966与其亲本以及近缘品种济麦22的叶片颜色深浅有一定差异，颜色由深到浅的品种顺序依次为衡9966、济麦22、良星99、良星66。

图1 参试小麦基因型的苗期叶片颜色Fig.1 Leaves color performance of 4 genotypes young seedlings in field

2.2 参试小麦基因型的叶绿素组分分析

测定结果（表1和2）显示，衡9966与其亲本以及近缘品种济麦22的叶绿素含量及其组成差异较大，其中，叶绿素a含量分别较良星66、良星99、双亲平均值、济麦22高57.89%、46.34%、51.90%和17.65%，叶绿素b含量分别较良星66、良星99、双亲平均值、济麦22高49.17%、35.74%、42.14%和13.30%，叶绿素a+b含量分别较良星66、良星99、双亲平均值、济麦22高55.97%、42.89%、49.14%和16.56%，差异均达到了极显著水平；叶绿素a/b分别较良星66、良星99、双亲平均值、济麦22高6.43%、7.31%、6.87%和4.08%，其中，与双亲及其平均值差异达到了显著水平，但与济麦22差异不显著。可以看出，衡9966的叶绿素a、叶绿素b和叶绿素含量以及叶绿素a/b均出现了明显的超中亲和超高亲优势。

表1 参试小麦基因型的叶绿素含量及其组成Table 1 Recording of chlorophyll content and com position of genotypes

表2 衡9966与双亲以及济麦22叶绿素含量及其组成的比较Table 2 Comparison of chlorophyll content and composition of Heng 9966 w ith its parents and Jimai 22

3 结论与讨论

统计分析结果表明，衡9966与亲本良星99和良星66以及亲本近缘品种济麦22相比，叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素a+b含量和叶绿素a/b均出现了正向超亲优势，其中，叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b含量差异均达到了极显著水平；而叶绿素a/b，与双亲相比差异达到了显著水平，但与济麦22差异并不显著。上述结果，与SNP（单核苷酸多态性）芯片Wheat660对良星99和良星66材料分析，多态性位点32 663个的结果（另文报道）相同。

衡9966与双亲以及亲本近缘品种济麦22叶片颜色的差异，主要是叶绿素a含量发生变化引起[26，33]，其叶绿素a含量分别超双亲46.34%和57.89%，本研究结果高于韦宏恩等[33]后代超双亲29.16%和38.41%的试验结果，可能与试验所选亲本、亲本遗传力以及后代选育方法的不同有关。鉴于衡9966既来源于双亲杂交，且中间F0和F1种子又经过辐射处理，二者对叶绿素组成、比例及叶绿素总含量的影响，有待进一步研究。

本研究结果显示，衡9966的叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素a/b均明显地超过了高亲值，揭示出该现象与双亲遗传背景有关。与前人叶绿素含量a/b是稳定的遗传性状，具有杂种优势，属数量遗传性状，受微效多基因控制的研究结论[22，34]相一致。张志鹏[31]对24个小麦品种叶绿素观察发现，不同品种间叶绿素含量差异较大，最低品种与最高品种相差18.7%，并认为叶绿素a含量、b含量、a+b含量和a/b均能影响小麦基因型的一般配合力以及特殊配合力，而小麦基因型的一般配合力与特殊配合力都能直接或间接地影响小麦叶绿素的遗传力。本研究中，衡9966与亲本良星99和良星66在叶绿素a含量、叶绿素b含量及叶绿素a+b含量上差异均达到了极显著水平，对生理育种亲本选择和后代选育带来了启示。在小麦育种实践中注重生理学与遗传学相结合进行生理育种，注重亲本叶绿素含量以及叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素a+b含量、叶绿素a/b选择，将为实现光合速率与抗逆性的同步提高提供遗传基础。上述4个指标均具有超亲优势，育种选择十分有效。同时，与亲本相比，衡9966较高的叶绿素含量及a/b，揭示出其抗逆性和丰产性较双亲更突出，展示出其应用前景。该结论已在芹菜、菠菜、豌豆及芝麻等其他植物上所证实[35～37]。

叶绿素组分、比例及叶绿素总含量等参数可以作为检测品种真实性的手段和方法之一，用于知识产权保护和新品种审定及管理。目前，有关衡9966较高的叶绿素含量和a/b与其抗逆性、丰产性以及与亲本之间的遗传关系研究将进一步开展，部分试验正在进行之中。

［1］王凤涛，蔺瑞明，欧阳宏雨，徐世昌.利用SRAP标记分析河南小麦栽培品种的遗传多样性［J］.植物遗传资源学报，2009，10（4）：517-521.

［2］冯夏莲，何承忠，张志毅，安新民，王冬梅.植物遗传多样性研究方法概述［J］.西南林学院学报，2006，26（1）：69-74.

［3］田妍妍.农业知识产权的法律保护［J］.农业发展，2016，（2）：59-60.

［4］GB/T 19557.1—2004，植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则［S］.

［5］张超，周衍平.基于创新情境下的植物新品种保护问题及对策研究［J］.山东科技大学学报，2016，18（2）：73-79.

［6］李宏博，庞斌双，刘丽华，刘阳娜，赵昌平，陈景堂.河北区试小麦品种（系）DNA指纹图谱构建及遗传差异分析［J］.生物技术通报，2015，31（6）：93-99.

［7］李媛辉.对农作物品种审定制度的再思考——演变、评述、反思与展望［J］.求索，2015，（10）：120-125.

［8］王凤格，赵久然，田红丽，杨扬，易红梅.农作物品种DNA指纹库构建研究进展［J］.分子植物育种，2015，13（9）：2118-2126.

［9］李莉，王俊峰，颜廷进，颜廷进，李娜娜，丁汉凤，樊守金.基于SSR标记的山东省小麦DNA指纹图谱的构建［J］.植物遗传资源学报，2013，14（3）：537-541.

［10］Annicchiarico P.Using univariate and multivariate statistical methods for the assessment of variety distinctness［J］.Sementi Elette，2000，（46）：541-547.

［11］Patterson H D，Stac W.Statistical criteria for distinctness between varieties of herbage corps［J］.Journal of Agricultural Science，1984，102（1）：59-68.

［12］Eeuwijk F A V，Law J R.Statistical aspects of essential derivation，with illustrations based on lettuce and barley［J］.Euphytica，2004，137（1）：129-137.

［13］陈海荣，顾晓君.水稻新品种测试中性状差异显著性判定的分析［J］.上海农业学报，2003，19（4）：18-20.

［14］徐振江，刘洪，李春兰，李之林，任永浩.水稻新品种DUS测试数量性状特异性统计分析判别研究［J］.华南农业大学学报，2008，29（1）：6-9.

［15］刘青林，张云，原雅玲，彭隆金.百合品种一致性、稳定性与特异性的研究［J］.北京林业大学学报，2002，24（1）：35-40.

［16］孙延智，义鸣放.唐菖蒲品种的特异性、一致性和稳定性研究［J］.中国农业大学学报，2002，7（5）：7-13.

［17］郝京辉，游捷，秦贺兰，义鸣放.菊花品种的特异性、一致性和稳定性的研究［J］.中南林学院学报，2003，23（5）：14-18.

［18］张肖娟，孙振元.植物新品种保护与DUS测试的发展现状［J］.林业科学研究，2011，24（2）：247-252.

［19］刘贞琦.水稻叶绿素含量及其光合速率关系的研究［J］.作物学报，1984，10（1）：57-62.

［20］傅兆麟.小麦科学研究理论与实践［M］.北京：中国农业科技出版社，2001.

［21］王正航.小麦旗叶叶绿素含量及荧光动力学参数与产量的灰色关联度分析［J］.作物学报，2010，36（2）：217-227.

［22］娄义龙，刘振业.烟草光合作用的遗传研究Ⅳ.叶绿素含量的遗传及其与产量的关系［J］.贵州农学院学报，1994，13（2）：1-7.

［23］牛立元，茹振钢.小麦叶片叶绿素含量系统变化规律研究［J］.麦类作物，1999，19（2）：36-38.

［24］董连生.小麦耐光氧化性、叶绿素含量与千粒重、籽粒密度关系研究及其分子标记开发［D］.合肥：安徽农业大学，2012.

［25］李合生，孙群，赵世杰，章文华.植物生理生化实验原理和技术［M］.北京：高等教育出版社，2000.

［26］王超，张兵涛，王文秀.小麦叶片叶绿素的提取及其稳定性研究［J］.湖南农业科学，2012，（23）：38-41.

［27］Wang Y，Meng Y L，Ishikawa H，Hibino T，Tanaka Y，Nii N，Takabe T.Photosynthetic adaptation to salt stress in three-color leaves of a C4 plant Amaranthus tricolor［J］.Plant and Cell Physiology，1999，40（7）：668-674.

［28］Delfine S，A lvino A，Maria C，Loreto F.Restrictions to carbon dioxide conductance and photosynthesis in spinach leaves recovering from salt stress［J］.Plant Physiol，1999，119（3）：1101.

［29］Carter D R，Cheeseman J M.The effect of external Na－Cl on thylakoid stacking in lettuce plants［J］.Plant Cell and Environment，1993，16（2）：215-223.

［30］张志鹏，傅兆麟.小麦叶片叶绿素含量与产量关系研究进展综述［J］.安徽农学通报，2015，21（10）：36-37，81.

［31］张志鹏.小麦叶绿素含量遗传特性的研究［D］.淮北：淮北师范大学，2015.

［32］张宪政.植物叶绿素含量测定——丙酮乙醇混合液法［J］.辽宁农业科学，1986，（3）：26-28.

［33］韦宏恩，张庆勤.重组六倍体普通小麦的光合特性研究Ⅰ.叶绿素a.b含量及其比值的研究［J］.耕作与栽培，1992，（4）：35-38.

［34］刘贞琦，刘振业，马达鹏，曾淑芬，梁镇林，赵玖.水稻叶绿素含量的遗传研究［J］.山地农业生物学报，1983，4（2）：122-128.

［35］Everard J D，Gucci R，Kann S C，Loescher W H.Gas exchange and carbon partitioning in the leaves of celery（Apium graveolens L.）at various levels of root zone salinity［J］.Plant Physiology，1994，106（1）：281-292.

［36］Robinson S P，Downton J S，Millhouse J A.Photosynthesis and ion content of leaves and isolated chloroplasts of salt-stress spinach［J］.Plant Physiol，1983，73（2）：238-242.

［37］Rao G G，Rao G R.Pigmentcompositionandchlorophyllase activity in pigeon pea（Cajanus indicus Spreng）and Gingelley（Sesamum indicum L.）under NaCl salinity［J］.Indian Journal of Exprimental Biology，1981，19：768-770.

Analysis of Chlorophyll Composition of W heat Genotype Heng 9966 w ith Its Parents and Their Closely Related Variety

SHI Li-ran1，ZHAO ming-hui2，LI Hui-min2，QIAO Wen-chen2，SUN Shu-luan2，MENG Xiang-hai2，LI Ding2，LI Qiang2，WEI Jian-wei2，BAI Li-rong1，ZHAO Feng-wu2*
（1.Hengshui University，Hengshui 053000，China；2.Hebei Key Laboratory of Crop Drought Tolerance Research，Dry Farming Institute of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Hengshui 053000，China）

This paper analyzed the composition，proportion and total content of chlorophyll in wheat parents，their offspring and their closely relative cultivars，in order to provide basis for variety breeding and protection of intellectual property rights from the physiological point of view.Leaves of seedlings of winter wheat genotypes Heng 9966 and the parents of Liangxing 99 and Liangxing 66，and their closely relative cultivar Jimai 22 were sampled，4 indexes of chlorophyll a，chlorophyll b，the ratio of chlorophyll a with chlorophyll b（a/b）and total chlorophyll content were analyzed by ways of significant test.Results showed that the 4 indexes of chlorophyll a，chlorophyll b，the total chlorophyll of a＋b content and the ratio of chlorophyll a with chlorophyll b（a/b）of Heng 9966 were all higher than those 3 ones.Among them the chlorophyll a，chlorophyll b and chlorophyll a＋b content were all matched extremely significant differences at 0.01 levels than that of parents，mid-parent value and Jimai 22.The ratio of a/b was 0.05 significantly higher than the parents and mid-parent value，but there was no difference with Jimai 22.The content of chloroph yll a of Heng 9966 was 57.89%，46.34%and 17.65%higher than that of Liangxing 66，Liangxing 99 and Jimai 22，respectively，that led to the deep er color of leaves.The 4 indexes of chlorophyll a，chlorophyll b，chlorophyll a+b and chlorophyll a/b were all demonstrated positive super parent heterosis，and theselection of breeding was very effective.Parameters of chlorophyll composition，proportion，and total content could be used as one of the means and methods to detect the authenticity of varieties and for the protection of intellectual property rights.

Wheat；Parents；Chlorophyll；Variety protection

S512.1＋1

：A

：1008-1631（2017）02-0072-05

2017-03-10

国家重点研发计划项目（2016YFD0101602）；国家重点研发计划项目（2016YFD0102101）；国家小麦产业技术体系项目（CARS-3-2）；河北省小麦产业技术体系项目

时丽冉（1970-），女，河北深县人，教授，主要从事植物生理学研究。E-mail：slr701212@163.com。

赵凤梧（1958-），男，河北枣强人，研究员，主要从事小麦遗传育种研究。E-mail：zhaofw@126.com。