绵羊miR-376e-3p的靶基因预测与GO功能分析

马元，胡子乔,2，张莹姣，张雁，申彩云，张富权，刘文忠*

(1.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801； 2.深圳市千年盛世基因科技有限公司，广东 深圳 518005；3.左云县畜牧兽医服务中心，山西 左云 037100)

绵羊miR-376e-3p的靶基因预测与GO功能分析

马元1，胡子乔1,2，张莹姣1，张雁3，申彩云3，张富权3，刘文忠1*

(1.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801； 2.深圳市千年盛世基因科技有限公司，广东 深圳 518005；3.左云县畜牧兽医服务中心，山西 左云 037100)

[目的]研究miRNA对脂肪代谢的调节作用，在一定程度上揭示脂肪代谢的分子机制。[方法]本研究选取实验室前期高通量测序结果中的miR-376e-3p进行研究，其在不同脂尾型绵羊尾部脂肪组织中差异表达显著，是脂肪代谢的关键miRNA。用3种软件对miR-376e-3p进行靶基因预测，并对预测结果进行GO通路富集分析。[结果]MiR-376e-3p有25个潜在的靶基因，其中21个基因富集到3种分子功能，23个基因富集到14个生物学过程中，其中Vldlr具有脂蛋白粒子受体活性。[结论]推测miR-376e-3p可能通过调节其潜在靶基因Vldlr参与脂肪代谢。为进一步研究miR-376e-3p和Vldlr在绵羊脂肪代谢中的作用奠定了基础。

绵羊； miR-376e-3p； 靶基因预测； GO分析

MicroRNA是一类具有调节作用的小分子RNA，其自身并不编码蛋白质，长度约为18～24 nt，主要通过与其靶基因mRNA序列3′ UTR[1]或者5′ UTR[2]的碱基互补配对，也有部分通过与CDS区域结合，导致mRNA降解或抑制其表达，从而实现对基因表达的转录后调控。目前，已发现很多miRNA参与不同的生物学过程，并对它们的靶基因及调节功能进行了研究[3～5]。

脂肪是动物的的重要能量贮存组织。肉用家畜脂肪含量的多少是衡量肉质品质的一个重要的指标。研究表明，miRNA在人类和小鼠脂肪生成过程中可以调节很多功能基因，从而对脂肪细胞的增殖、分化、凋亡等多个环节发挥作用[6]。例如，miR-205可以抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖过程[7]，有些miRNAs可以调节前脂肪细胞的分化和其他生物过程[8,9]。从调节方式来说，miRNA既可上调[10]也可下调[11]脂肪的生成。

绵羊是一种重要的肉用家畜，研究人员不断地探究其脂肪代谢机制，以求更好的改良肉品质。本实验室前期已经通过高通量测序技术发现了在不同脂尾型绵羊尾部脂肪中差异表达的大量miRNAs[12]，并通过荧光定量PCR技术进一步证实包括miR-376e-3p在内的多个miRNAs在尾脂中差异表达显著，表明miR-376e-3p可能参与脂肪代谢。但miR-376e-3p及其靶基因在脂肪代谢中的作用机制尚不清楚。

本研究旨在利用生物信息学软件预测miR-376e-3p的靶基因，通过GO(gene ontology)基因本体[11]通路分析预测结果中的靶基因作用机制，注释其靶基因的生物学功能。本研究为miR-376e-3p及其靶基因在脂肪代谢调控方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究使用靶基因在线软件预测miR-376e-3p的靶基因，并利用Venn diagrams在线软件取交集靶基因，GO Tool对交集靶基因进行通路生物功能的富集。各软件的功能及网址见表1。

表1 生物信息学软件

1.2 试验方法

分别登录3个在线靶基因预测软件：miRGator、miRDB和MicroCosm Targets，搜索miR-376e-3p并进行靶基因预测，3个软件的预测结果都可以下载为Excel格式的文件。将这3个软件得到的预测结果用韦恩图取交集，得到相对可靠的miR-376e-3p潜在靶基因。MiRBase中绵羊的miR-376e-3p序列为：3′ AACAUAGAGGAAAA-UCCACAUU 5′，由于这3个预测软件的序列数据库中都没有绵羊的miRNA序列，而miRNA的种子序列在物种间的保守性很高[17]，所以我们统一选择模式生物“小鼠”的miR-376e-3p序列进行靶基因的分析预测。

登陆GO分析网站，将3个在线靶基因预测软件预测得到的交集基因进行GO分析，软件通过计算这些基因同GO中某一类或几类特定功能分支的分布关系，对每一个基因在通路中进行富集。

2 结果与分析

2.1 miR-376e-3p靶基因的预测

图1显示了MicroCosm Targets、miRGato和miRDB 3个软件预测出的靶基因韦恩图，靶基因数分别为744、465和319个，共得到25个交集靶基因。

图1 miRGator、miRDB和MicroCosm Targets预测结果的韦恩图Fig.1 Venn diagram of predicted results of miRGator, miRDB and MicroCosm Targets

2.2 miRNAs靶基因生物学功能的分析

对预测出的miR-376e-3p的25个靶基因进行Function Ontology分析，结果如表2所示。共富集到3种分子功能，具有结合功能的靶基因有21个，其中有7个基因既有DNA结合功能又有蛋白质结合功能(Neurod6,Bcl11a,E2f5,Aire,Rabgef1,Myf6,Smarca1)，3个基因只具有DNA结合功能(Zfp451,Hoxb6,Spo11)，11个基因只具有蛋白质结合功能(Fgb,Psmd3,Ctsh,Lims1,Hat1,Vldlr,Cxcl16,Ube2d,Sncb,Anln,Pdgfd)，其中Vldlr(Very low density lipoprotein receptor)和Cxcl16(chemokines 16)还具有脂蛋白粒子受体活性。

对预测出的miR-376e-3p的25个靶基因进行Process Ontology分析，结果如表3所示。共富集到包括4个代谢调控过程、5个代谢过程和5个生物发育过程在内的14个生物学过程。Neurod6,Hoxb6,Ctsh,Bcl11a,Lims1,E2f5,Aire,Myf6,Smarca1,Pdgfd共10个靶基因在14个生物学过程中均有参与。Fgb,Hat1,Vldlr,Ube2d1,Rabgef1,Zfp451共6个基因参与4个代谢调控过程；Spo11,Fgb,Psmd3,Vkorc1,Hat1,Vldlr,Ube2d1,Rabgef1,Zfp451共9个基因在5个代谢过程均有出现；Spo11,Vkorc1,Anln共3个基因为5个生物发育过程所共有。

表2 富集到Function Ontology的基因

3 讨论

MiRNA与其靶基因的研究通常分为生物信息学预测和试验验证两部分。现有的靶基因预测软件通常基于种子区的互补配对、序列的保守性、自由能的大小以及结合位点的开放性来分析[18]，其中一部分软件如MiRDB还具有机械学习的特点(machine learning)[19]。

本研究所用的3种靶基因预测软件基于不同的算法，通过算法间的互补提高miRNA预测的科学性和准确性[20]。MicroCosm Targets主要运用miRanda算法，识别要预测的miRNA的潜在结合位点。该算法要求mRNA的3′ UTR与种子序列完全互补，并通过碱基的配对评估miRNA-mRNA双体结构的热力学稳定性，且每个靶基因至少在数据库中的两个物种间是保守的[21,22]。综合这些特性，本研究利用该软件预测出744个miR-376e-3p的靶基因。miRGator对靶基因的预测有3种算法(miRanda, PicTar, TargetScan)可选择，本研究选择来自miRBase数据库的 miRanda算法预测到了465个miR-376e-3p的靶基因。由于miRGator除了具备MicroCosm Targets的特性，还具有位点的开放性预测，因此预测得到的结果比MicroCosm少。MiRDB的靶基因预测由MirTarge工具进行，利用机械算法鉴别miRNA靶基因结合位点相关的共同特征[23]。本研究中该软件预测出193个miR-376e-3p的靶基因，在3个软件中预测的靶基因最少。对3个软件的预测结果取交集，最终得到25个miR-376e-3p的靶基因，大大缩小了靶基因的范围，并在一定程度增加了预测的精确度。因此，为了缩小在靶基因预测时的盲目性和片面性，考虑不同预测软件的理论基础和特性是必要的。

GO共有3个本体，分别描述基因的分子功能(molecular function)、所处的细胞位置(cellular vocabulary)和参与的生物学过程(biologicalprocess)[24]。本研究就其中的2个本体进行了研究。分子功能分析发现，miR-376e-3p有21个靶基因富集到了3个分子功能，其中具有脂蛋白粒子受体活性的靶基因有Vldlr和Cxcl16。生物学过程分析发现，miR-376e-3p有23个靶基因分别富集于14个生物学过程中，其中Vldlr参与了除动物器官发育以外的13个生物学过程。早在2006年，P. Degrace等研究发现，Vldlr是肝脏合成甘油三酯的转运蛋白，与脂肪代谢密切相关[25]。2014年Nguyen等[26]以小鼠的前体脂肪细胞为研究对象，进一步证实Vldlr是调节脂肪代谢的关键基因，具有诱导脂肪生成，促使脂肪细胞肥大的作用。同样具有脂蛋白粒子受体活性的靶基因Cxcl16，在相关研究中主要侧重于动脉硬化、炎症性疾病和HIV病毒感染[27]，在脂肪代谢的研究中并不多见。因此，推测miR-376e-3p可能通过作用于其潜在靶基因Vldlr调控绵羊的脂肪代谢。

表3 富集到Process Ontology的基因

4 结论

3种靶基因预测软件分析得到25个miR-376e-3p的潜在靶基因。这些基因一共富集到包括3种分子功能和14个生物学过程，其中miR-376e-3p可能通过作用于其靶基因Vldlr在绵羊的脂肪代谢中发挥一定的作用。

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(编辑：武英耀)

Target genes prediction and GO functional analysis of the ovine mir-376e-3p

Ma Yuan1, Hu Ziqiao1,2, Zhang Yingjiao1, Zhang Yan3, Shen Caiyun3, Zhang Fuquan3, Liu Wenzhong1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China； 2.MillenniumGenomicsIncorporated,Shenzhen518005,China； 3.TheanimalhusbandryandveterinaryservicecenterofZuoyun,Zuoyun037100,China)

[Objective]Study the regulation of miRNA on fat metabolism can partly reveal the molecular regulatory mechanism of the fat metabolism.[Methods]This study selected miR-376e-3p from theresult of high throughput sequencing by our lab before, this miRNA was significant differentially expressed between tail fat tissues from different fat-tailed sheep, and it was a key miRNA of fat metabolism. Three different prediction softwares were used to predict the target genes of miR-376e-3p, and mapping those predicted genes to pathways by GO.[Results]Theresult showed that miR-376e-3p has 25 potential target genes, and 21 of them are mapped to 3 different function ontology, 23 of them mapped to 14 different process ontology, among those genesVldlrhas lipoprotein particle receptor activity.[Conclusion]We speculated that miR-376e-3p may regulate the fat metabolism by through its potential target genesVldlr. This study lays a foundation for further study the function of miR-376e-3p andVldlrin ovine fat metabolism.

Sheep, MiR-376e-3p, Target gene prediction, GO analysis

2017-03-31

2017-04-22

马元(1990-)，男(汉)，山西太原人，硕士研究生，研究方向：肉用绵羊的分子遗传育种

*通信作者：刘文忠，教授，博士生导师，Tel: 0354-6288337；E-mail: tglwzyc@163.com

国家自然科学基金(31372292)

S826

A

1671-8151(2017)07-0499-05