VEGF抑制剂阿西替尼对人胃癌细胞周期及凋亡的影响

袁春秀，王宁菊，吴 婧

VEGF抑制剂阿西替尼对人胃癌细胞周期及凋亡的影响

袁春秀，王宁菊，吴 婧

目的 研究VEGF抑制剂阿西替尼( Axitinib)对人胃癌细胞AGS细胞周期和凋亡的影响。方法 采用流式细胞仪检测0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L的阿西替尼作用AGS细胞24 h后对细胞周期的影响；采用同样方法检测该药对AGS细胞凋亡的影响。结果 阿西替尼将AGS细胞抑制在G2/M期，并呈浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。阿西替尼引起AGS细胞的凋亡，随着给药浓度增加，AGS细胞凋亡率也随之增加，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 阿西替尼通过把胃癌AGS细胞阻滞在G2/M期而抑制细胞的增殖，并促进胃癌AGS细胞凋亡。

胃癌AGS细胞系；Axitinib；细胞周期；细胞凋亡

胃癌是全球消化道常见肿瘤之一，目前已成为世界上发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。至今其病因及发病机制尚未完全阐明，从肿瘤细胞学角度，本质在于细胞增殖与凋亡的调节失控[1]。近年来肿瘤靶向药物的研究取得了很大进展。阿西替尼( Axitinib) 是一种以酪氨酸激酶为靶向、抑制血管生成的新抗肿瘤药，主要作用靶点是血管内皮生长因子受体VEGFR-2[2]。目前已用于晚期肾细胞癌、非小细胞肺癌治疗中[3-5]，但Axitinib在胃癌治疗方面的作用仍不清楚。本研究以体外培养人胃癌AGS细胞为研究对象，观察Axitinib对胃癌细胞周期及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料：人胃癌AGS细胞系购自美ATCC公司，DMEM细胞培养基购于美国Corning Cellgro，细胞凋亡试剂盒购于美国BD Biosciences公司。阿西替尼购自美国 Glaxo Smith Kline公司，胎牛血清(FBS)、PBS、RNase A、细胞周期测试PI均购于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 胃癌细胞的复苏与培养：DMEM培养液中加入10%FBS和1%青霉素-链霉素溶液备用。从-80 ℃冰箱中取出AGS胃癌细胞，放入 37℃水浴锅中复苏， 1 000 min离心5 min，弃上清液，用10% FBS的DMEM 培养液重悬细胞种于培养瓶中；再置于37 ℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养,第2天观察细胞生长情况。更换培养液，每3 d传代1次，将细胞培养至对数生长期。

1.2.2 细胞周期的检测：将AGS细胞接种于六孔板中，细胞长至80%，用浓度分别为0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L的Axitinib处理24 h后，再用胰酶消化收集细胞至流式管中，使用预 冷的PBS缓冲液洗2遍；加入75%冰乙醇，在4 ℃冰箱固定过夜。第2天，使用预冷PBS重悬细胞，离心收集细胞，加入500 μl PBS[含50 μg/mL碘化丙锭(PI)和50 μg/mL RNase A]，4 ℃避光孵育30 min。流式细胞仪检测，每个实验重复3次。

1.2.3 细胞凋亡的测定：将AGS细胞接种于六孔板中，细胞长至80%，用浓度分别为0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L的Axitinib处理24 h后，再用胰酶消化收集细胞至流式管中，使用预冷的PBS缓冲液洗2遍。每个流式管中加入结合缓冲液400 μl，震荡重悬细胞，然后加入5 μl Annexin- V-FITC，4 ℃冰箱避光孵育15 min；再加入碘化丙锭(PI)5 μl， 4 ℃孵育15 min(避光)。用预冷PBS洗一遍细胞，使用流式细胞仪检测，每个实验重复4次。

2 结果

2.1 Axitinib改变人胃癌AGS细胞周期的分布：采用流式细胞仪检测各实验组细胞周期的变化，结果显示Axitinib处理AGS细胞24 h后明显将AGS细胞阻滞在G2 /M期，与0 μM比较，存在浓度依赖性。用0.1 μmol/L、1 μmol/L及5 μmol/L的Axitinib处理AGS细胞24 h后，随着浓度升高，细胞处于G2 /M期比例增多(图1，目录后)，分别为(15.13±1.29)%、(30.5±0.68)%、(78.92±0.75)%(P<0.05)；而处于G1期和S期的细胞比例，随着浓度增高而下降 (P<0.05)，见表1。

表1 不同浓度Axitinib对AGS细胞周期(24 h)的影响

2.2 Axitinib诱导人胃癌AGS细胞的凋亡：用流式细胞仪检测AGS细胞凋亡，随着给药浓度(0.1 μmol/L、1 μmol/L及5 μmol/L)的增加，AGS细胞凋亡率(早期+晚期)也随之增加。与对照组比较，在5 μM浓度时，细胞凋亡率增加了近3.5倍，差异有统计学意义 (P<0.05)，见表2。

表2 不同浓度Axitinib对AGS细胞凋亡(24 h)的影响

3 讨论

Axitinib是一种小分子TKI,主要靶向于VEGFR酪酸激酶、抑制血管生成的小分子抗癌药[5],可介导多条信号通路抑制诸多受体酪氨酸激酶，包括血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板源生长因子受体(PDGFR)、纤维母细胞生长因子受体(FGFR)、表皮生长因子受体(EGFR),以及整合蛋白等细胞表面受体[6]，这些受体和病理性血管的发生、 肿瘤发生及生长有关。已有研究报道，在乳腺癌、结肠癌和肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤异种移植模型中，Axitinib表现出良好的抗肿瘤活性与抑制血管生成的作用[7-12]。

本研究通过流式细胞仪检测细胞周期，结果显示各浓度Axitinib试验组细胞在G2 /M期的分布比例差异有统计学意义，表明Axitinib可特异性地将胃癌AGS细胞阻滞在G2 /M期,通过改变肿瘤细胞周期来发挥抑制肿瘤细胞增殖。本研究还表明Axitinib可诱导人胃癌AGS细胞发生凋亡，进而抑制肿瘤的生长。

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Effect of VEGF inhibitor Axitinib on cell cycle and apoptosis of gastric cancer cell line

YUANChunxiu，WANGNingjiu，WUJing.

1.DepartmentofOncology,GeneralHospitalNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004，Ningxia,China

WANGNingju,Email:doctorning@163.com

Objective To study the effect of VEGF inhibitor-Axitinib on the cell cycle and apoptosis of the AGS cell.Method The effect of axitinib on the cell cycle and apoptosis were analyzed using the flow cytometer by double staining with annexinV and propidium iodide.Results Axitinib can induce the cell-cycle of the AGS cell in G2/M phase and can induce the apoptosis in AGS cell，which were concentration-dependent.Conclusion Axitinib can inhibit the proliferation of AGS by arresting the cells in G2/M phase and inducing the apoptosis.

Axitinib;Gastriccancer;Cellcycle;Apoptosis

10.13621/j.1001-5949.2017.06.0494

宁夏医科大学总医院肿瘤医院肿瘤内科，宁夏 银川 750004

袁春秀(1976-)，女，硕士研究生，副主任医师，主要从事肿瘤内科临床与应用基础研究工作。

王宁菊，Email：doctorning@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170614.1314.012.html

R737.11

A

2016-07-11 [责任编辑]马兴忠