1株华木莲内生真菌的抗氧化活性分析和菌株鉴定

刘紫英 袁斌 冷桂华

摘要：华木莲（Sinomanglietia glauca Z.X.Yu et Q.Y.Zheng）为木兰科中我国特有的单种属植物，全世界唯宜春特有的珍稀濒危新树种，对从华木莲叶片中分离的多株内生真菌进行抗氧化活性分析，筛选出抗氧化性较高的菌株并鉴定。筛选华木莲叶片的内生真菌，制备其发酵液提取物，采用TBA反应法、超氧阴离子自由基（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）、羟基自由基（·OH）清除能力的分析测定其抗氧化活性，对抗氧化活性高的内生真菌菌株利用试剂盒提取内生真菌总DNA，扩增其rDNA的ITS序列并测序。结果显示，菌株SL-3的总抗氧化活性很高，比对照、以维生素C为底物的高。通过对抗氧化活性成分的分析可知，该菌株含有黄酮类化合物。对菌株SL-3进行形态和分子鉴定，确定为产黄青霉（Penicillium chrysogenum）。说明内生真菌SL-3产黄青霉具有明显和稳定的抗氧化活性，可用于抗氧化活性成分发酵生产的微生物资源。

关键词：华木莲；内生真菌；抗氧化活性；ITS序列；黄酮类化合物；菌株鉴定；产黄青霉；微生物资源

中图分类号： S567.23+9.01文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0213-04

华木莲（Sinomanglietia glauca Z.X.Yu et Q.Y.Zheng）别称落叶木莲，为我国特有单种属植物，属于木兰科，已被列为国家Ⅰ级重点保护植物，全球仅狭域分布于江西省宜春市，是特有的珍稀树种。目前，国内外仅施建敏等对华木莲叶黄酮类化合物和多糖的抗氧化作用进行了研究，结果显示，华木莲叶内黄酮类化合物和多糖的抗氧化性效果很好[1-2]，華木莲具有潜在的利用价值，可成为抗衰老保健品辅料或功能因子[3]。现有研究结果表明，植物内生真菌可能产生与其宿主体内相同或相似的生理活性成分，植物内生菌是分离新的天然活性成分和开发新药的潜在资源，成为当今的研究热点[4-5]。笔者前期已研究过华木莲叶中内生真菌的群落结构[6]，分离并鉴定74株华木莲叶内生真菌。现以华木莲的内生真菌为研究对象，通过对多株内生真菌进行发酵振荡培养，利用硫巴比妥酸（TBA）反应法、超氧阴离子自由基（O-2[KG-*2]· [KG-*3]）、羟基自由基（·OH）清除能力研究其培养液提取物具有抗氧化活性，筛选出抗氧化活性成分的内生真菌并鉴定其种属。

1材料与方法

1.1试验材料

华木莲取材于江西省宜春市明月山风景区周边林木种植场所，分别取新鲜健康植株的叶片，组织分离法分离内生真菌，菌株存于宜春学院江西省天然药物活性成分研究重点实验室微生物药物实验室，分别编号为SL-1、SL-2、SL-3、SL-22、SL-56、SL-68。

1.2培养基

察氏培养基培养液成分包括NaNO3 2.0 g、K2HPO4 1.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4 0.5 g、硫酸铁0.01 g、蔗糖30 g，水 1 000 mL，pH值自然，121 ℃灭菌20 min。

1.3仪器与设备

高速离心机（TGL-16G型）、紫外可见分光光度计 SFZ-UV-2000型（龙尼柯仪器有限公司）、数显恒温水浴锅HH-6（国华电器有限公司）、EHG-B恒温摇床培养箱（江苏亿通电子有限公司）、PHSJ-4A精密酸度计（上海雷磁分析仪器厂）、RE-2000A旋转蒸发器（上海嘉鹏科技有限公司）、大龙移液器手动单道可调移液枪100～1 000 μL（芬兰Dragonmed公司）、SHZ-III/SHZ-IIID循环水真空泵（上海京工实业有限公司）。

1.4样品与试剂

芸香苷标准品（10270-200901，中国药品生物制品检定所）、硫巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸、正丁醇、抗坏血酸、葡萄糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、七水硫酸镁、硫酸铁、精制花生油、邻苯三酚、水杨酸钠、过氧化氢、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醚等，以上试剂均为分析纯。

1.5试验方法

1.5.1菌株活化并扩大培养从实验室保存的菌种中挑取少量接种于察氏培养基上培养6 d，用打孔器在平板上取长势较好的培养菌丝并接种，用于扩大培养。在 250 mL 三角瓶中装100 mL察氏液体培养基，用12层纱布包好都放入灭菌锅中灭菌20 min，于28 ℃、160 r/min下振荡培养7 d。

1.5.2发酵液提取物的制备将培养液进行抽滤除去菌丝和菌丝球，利用旋转蒸发器进行减压蒸发浓缩，将100 mL的培养液浓缩至3～4 mL，加入足量无水乙醇振荡，提取，于 5 000 r/min 下离心15 min，弃沉淀，留上清液。将上述提取液用无水乙醇定容至25 mL。

1.5.3TBA反应法测定培养液提取物抗氧化活性[7]采用的TBA反应法略有改动，配制2.5%精制花生油乙醇溶液作为底物，在各个比色管中分别加入0.02%芸香苷、抗坏血酸和菌株培养液提取物（以上均采取底物4 mL、反应6 mL进行反应），混匀后于37 ℃水浴中存放；每24 h取出1 mL待测液样品，加入1 mL 25%三氯乙酸，混匀，放置5 min，然后加入 1 mL 0.67% TBA，于沸水中加热20 min；取出，冷却，再加入 4 mL 正丁醇，剧烈振荡，于4 000 r/min下离心10 min，取上层正丁醇液，于532 nm波长处比色；以蒸馏水代替抗氧化剂的空白样品作为对照，存放24、48、72、96、120、144 h后测D532 nm值。

1.5.4超氧阴离子自由基（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）清除能力的测定[8]

采用邻苯三酚自氧化进行测定，取4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH值8.2），4.2 mL蒸馏水混匀后在25 ℃水浴中保温20 min，取出后立即加入在25 ℃水浴中预热过的 3 mmol/L 邻苯三酚0.3 mL，迅速摇匀，倒入比色杯，325 nm下每隔30 s测定吸光度，计算线性范围内1 min内吸光度的增加量，以 10 mmol/L HCl溶液配制空白管作为对照。按照上述方法步骤加入邻苯三酚前先分别加入0.1 mL不同的样品液，同样10 mmol/L HCl溶液配制空白管作为对照，同样方法测定吸光度。前后2次的样品吸光度差（ΔD）与测定时间差（ΔT）的比值即为该时段的邻苯三酚自氧化速率。

[JZ]清除能力率=（ΔD1/ΔT-ΔD2/ΔT）/ΔD1/ΔT×100%。

式中：ΔD1/ΔT代表邻苯三酚自氧化时反应速率；ΔD2/ΔT代表加入样品液后邻苯三酚自氧化反应速率。

1.5.5样品对羟基自由基（·OH）的清除率[9]

采用水杨酸比色法进行测定，在4 mL反应液（含0.15 mol/L硫酸亚铁1 mL、6 mmol/L水杨酸钠1 mL）中加入不同浓度的样品 1 mL，再加入双氧水启动反应；37 ℃水浴中反应1 h，测定 510 nm 處的吸光度，吸光度越大，则清除羟基自由基效果越好。

[JZ]·OH清除率=[D0-（Di-D0i）]/D0×100%。

式中：D0代表用蒸馏水代替样品的的对照值；Di代表加样品后的吸光度；D0i代表样品本底吸光度。

1.5.6芸香苷标准曲线的绘制和发酵液中黄酮类化合物浓度的测定[10]

1.5.6.1标准曲线的绘制称取0.001 5 g芸香苷标样，溶于15 mL的30%乙醇溶液中，分别取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 此溶液于10 mL比色管中，各补加30%乙醇溶液使成5 mL体积。加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；加100 mg/L硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；加1 mol/L氢氧化钠溶液4.0 mL，再加蒸馏水稀释到刻度，摇匀，静置 15～20 min后，于510 nm处测定吸光度D。

1.5.6.2样品浓度的测定分别取6个不同编号的10 mL比色管，装入样品各5 mL，依次加入50 mg/L亚硝酸钠 0.3 mL，静置6 min；加100 mg/L硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；加1 mol/L氢氧化钠溶液4.0 mL，静置15～20 min，同时以30%乙醇溶液代替样品液配制空白试剂，在510 nm处测定吸光度D。

1.5.7抗氧化活性高的内生真菌菌株的分子鉴定

用生工生物工程上海（股份）有限公司的真菌基因组DNA提取试剂盒和PCR试剂盒进行扩增、ITS（internal transcribed spacer）序列分析，即根据已知真菌的保守序列设计1对特异性引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），PCR扩增采用20 μL反应体系，反应条件：94 ℃ 1 min；55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 个循环；72 ℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收纯化目的片段，纯化产物由生工生物工程上海（股份）有限公司测序。以NCBI数据库中Blastn程序比对分析，使利用MEGA 6.0软件和邻接法（neighbour-joining methods）进行聚类分析鉴定种属。

2结果与分析

2.1TBA反应法测华木莲内生真菌抗氧化活性

以2.5%精制花生油乙醇溶液作为底物进行反应，其结果见表1。清除率=（对照的D532 nm-样品的D532 nm）/对照的D532 nm×100%。由表1可知，D532 nm值越小，抗氧化活性越高。随时间的延长，该6株内生真菌的发酵液提取物与各抗氧化剂均不同程度抑制了花生油的脂质过氧化。培养144 h时停止该试验，数据显示抑制作用还很明显，其样品清除率从大到小依次为SL-3>SL-68>SL-22>维生素C>SL-1=芸香苷>SL-2>SL-56，由此可见菌株SL-3、SL-68、SL-22可以较显著地延缓花生油的脂质过氧化过程，具有相对较强的抗氧化能力，值得进一步研究。

2.3华木莲内生真菌发酵液对羟基自由基的清除率

从表3可知，华木莲内生真菌发酵液对羟基自由基的清除率从大到小依次为SL-3>SL-68>SL-22>SL-2>SL-56>SL-1，相对于超氧阴离子自由基的清除率普遍较高。内生真菌SL-3、SL-68、SL-22对羟基自由基的清除率都比较高，其中SL-3的清除率为64.03%，远远高于其他菌株，显示出很高的抗氧化性。

2.4内生真菌培养液的抗氧化物质中黄酮类化合物浓度

由不同浓度芸香苷绘制得到标准曲线（图1），根据该曲线得到标准方程：y=0.018 9x-0.046 2，r2=0.963 3。式中，x代表芸香苷浓度；y代表吸光度。

同样有6种样品在510 nm处的吸光度以及代入式中得到[CM（25]的抗氧化物质的浓度见表4。从表4可以看出，SL-3、

综上可知，内生真菌SL-3的TBA可以较显著地延缓脂质过氧化过程，具有相对较强的抗氧化能力，对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率效果很好；SL-3含黄酮类抗氧化物质浓度较高，为34.338 μg/mL，是抗氧化性物质高产菌株，因而对其进行种属鉴定。

2.5华木莲内生真菌SL-3种属鉴定

华木莲内生真菌SL-3形态学鉴定的方法参见笔者前期的华木莲叶中内生真菌的群落结构研究[6]，其形态学特点为

典型的青霉属真菌，现对其进行分子鉴定，经扩增5.8S rDNA序列，并测序内生真菌SL-3的ITS区含548 bp，通过GenBank中进行Blast比对，应用MEGA 6.0软件中邻接法（neighbour-joining methods，NJ）构建聚类分析树状图，bootstrap检验值≥50%，1 000次重复。基于10个菌株ITS序列采用邻接法构建系统发育树，以确证SL-3菌株的分类归属（图2），由此可以看出与内生真菌SL-3处于同一分支的4株菌株均为产黄青霉（Penicillium chrysogenum），并且这个菌株与产黄青霉的ITS序列相似性达99%。Renske等认为， 通过ITS区域比对，序列相似性≥99%，鉴别为相同种，即内生真菌 SL-3 鉴定为产黄青霉[11]。

3结论

目前，寻找外源性自由基清除剂和抗氧化剂来延缓衰老，已经成了国内外研究热点，木兰科植物黄酮类化合物含量的测定已有不少研究，但是抗氧化性能方面的研究很少。因此，本试验采用华木莲的内生真菌作为对象研究其抗氧化性，结果显示华木莲叶内生真菌SL-3是可以产生较多抗氧化物質的菌株，符合相关文献描述的植物内生真菌可以产生与植物本身相似或相同的抗氧化性物质[5]，而且提取物中的抗氧化物质还是比较多的，对于超氧阴离子自由基、羟基自由基有较强的抑制作用，它们的多种抗氧化活性预示着其产生相关抗氧化化合物的能力；有望成为较好的天然抗氧化性物质，为进一步对其发酵工艺研究成为抗衰老保健品的辅料或功能因子奠定理论基础。

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