改性壳聚糖的性质及对纤维素酶的固定效果

毛加宁+杨莹+农向

摘要：采用改性壳聚糖作为载体研究改性壳聚糖作为固定化材料对纤维素酶吸附大小的影响。结果表明，当交联剂浓度达到4%时对改性固定化酶活性影响最大，改性壳聚糖固定化酶的最适pH值为4.3，改性壳聚糖作为载体的固定化纤维素酶米氏常数为3.7×10-3，未改性壳聚糖为载体的固定化纤维素酶的米氏常数为7.2×10-3，用改性壳聚糖作为载体的固定化纤维素酶最适温度为55 ℃左右。结果表明，改性壳聚糖作为载体固定化纤维素酶可以提高游离酶的性质。

关键词：纤维素酶；壳聚糖；固定化；改性

中图分类号： S188文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0160-04

纤维素作为地球上最丰富的可再生资源，具有广阔的开发利用前景，以纤维素酶为固化对象，通过试验比较化学改性与未改性壳聚糖固化酶载体，探索固化酶的制备方法与性质，旨在研究固化酶的最适条件，从而改善传统意义壳聚糖固定化纤维素酶的相关研究。甲壳类动物废弃的外壳中可以提取一种多糖——壳聚糖，学名为2-氨基-1，4-β葡聚糖，含有极其丰富的甲壳素（chitin）。壳聚糖的结构与纤维素类似，也是至今为止在自然界中被发现的唯一的阳离子型可食用纤维，对疾病有很好的保健和预防作用[1-4]。由于分子中存在氨基，使其易于酶共价结合，也可络合金属离子，化学性质较稳定，耐热性好，经常作为固定化酶的载体[5-8]。本试验通过采用化学方法改性壳聚糖固定化纤维素酶，改变壳聚糖的某些分子结构，探索相比未改性壳聚糖分子更优化的性质。

本研究采用简单的化学方法对壳聚糖进行了改性，并采用拉曼光谱和X光衍射分别测定了改性壳聚糖的部分性质。最后，研究了改性壳聚糖固定化纤维素酶的效果。

1材料与方法

1.1试验材料

纤维素酶，壳聚糖，氨基硫脲-壳聚糖改性产物，3，5-二硝基水杨酸染色液，羧甲基纤维素钠盐溶液，其他试剂均为分析纯。

1.2试验方法

1.2.1纤维素酶液的制备取1 g纤维素酶，加入1 000 mL蒸馏水，充分搅拌直至全部溶解，得纤维素酶液，4 ℃保存备用。

1.2.2羧甲基纤维素钠盐溶液的配制准确称取1.00 g羧甲基纤维素钠，用50 mmol/L、pH值为 5.0的柠檬酸钠缓冲液加热溶解后，转移到100 mL容量瓶中，待冷却后，用该缓冲液定容至刻度，4 ℃保存备用。母液A（0.2 mol/L柠檬酸溶液）：称取42.03 g C6H8O7·H2O 溶解稀释至1 000 mL；母液B（0.2 mol/L 柠檬酸钠溶液）：称取58.82 g Na3C6H5O7·2H2O 溶解稀释至1 000 mL；取20.5 mL母液A和29.5 mL母液B混合，调节pH值至5.0，稀释至200 mL，即得 50 mmol/L、pH值为 5.0的柠檬酸钠缓冲液。

1.2.3固定化酶活性测定

在一定量固定化酶中（一般取0.1～0.5 g）加入一定量（一般为3.0 mL）羧甲基纤维素钠盐溶液，40 ℃水浴保温10 min后离心5 min，吸取反应液 2.0 mL，加入0.4 mL 2 mol/L NaOH溶液，加入0.8 mL 3，5-二硝基水杨酸显色剂，定容至6.2 mL，沸水浴中加热5 min后流水冷却，在最适条件（40 ℃）下，1 min内催化1 μmol底物转化为产物所需的酶量定为1个活性单位，用721分光光度计在490 nm处测定吸光度[5]。

1.2.4壳聚糖改性产物的制备

壳聚糖乙酸溶液的制备[1]：将1 g壳聚糖在100 mL蒸馏水中浸泡润湿15 min，然后加入40 mL 2.5%的乙酸溶液，充分搅拌使其溶解，即得到壳聚糖乙酸溶液。

壳聚糖改性吸附剂的制备：称取3 g氨基硫脲置于 250 mL 烧杯中，加入100 mL蒸馏水，加热搅拌至50 ℃时，逐滴加入6 mL 25%的戊二醛溶液，并充分反应45 min。加入配制好的壳聚糖乙酸溶液，加热至70 ℃，充分反应30 min后，取出反应物，流水冷却，再分3次加入80 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液，搅拌充分后，抽滤，用蒸馏水洗涤产物至滤液pH值为7.0，再用乙酸乙酯、无水乙醇分别洗涤后，放入真空干燥箱于60 ℃下至质量不再变化，最终获得淡黄色固体粉末状壳聚糖改性产物。

1.2.5纤维素酶的固定化

称取2 g改性壳聚糖，加入100 mL 6%的戊二醛，充分搅拌3.5 h直至溶解，静置24 h，3 000 r/min 离心5 min后弃去上清液，水洗2～3次以除去残余戊二醛，抽滤，往交联后的壳聚糖中加入1 g纤维素酶，室温下继续搅拌2.5 h，转入冰箱于4 ℃保存备用。静置24 h，3 000 r/min 离心5 min后弃去上清液，水洗2～3次，抽滤即得改性固定化酶；称取一定量的未改性壳聚糖作以上同样的处理，即得未改性固定化酶。

1.2.6酶活性的测定

葡萄糖含量的測定用3，5 - 二硝基水杨酸法，并作如下修改：1 mg/mL标准葡萄糖水溶液，浓度梯度终体积为4 mL，加入1 mL 3，5-二硝基水杨酸准确煮沸5 min，流水冷却后于520 nm处比色，利用标准曲线计算产生的葡萄糖量，从而计算酶活性，以葡萄糖质量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。最后做出的标准曲线公式为 y=1.935 40x-0.062 05，r2=0.996 51。

2结果与分析

2.1拉曼光谱（Raman spectra）

拉曼光谱（Raman spectra）是一种散射光谱。拉曼光谱分析法是基于印度科学家C.V.拉曼（Raman）所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。

拉曼光谱分析技术是以拉曼效应为基础建立起来的分子结构表征技术，其信号来源于分子的振动和转动。拉曼光谱分析技术对不同的物质具有不同的特征光谱，因此可以通过光谱进行改性壳聚糖的定性分析，根据物质对光谱的吸光度的特点，可以对改性壳聚糖物质的量进行分析。

改性壳聚糖或未改性壳聚糖的拉曼光谱都产生了明显的波长变化，随着拉曼频移逐渐增大，壳聚糖的拉曼光强逐渐减小，相比未改性壳聚糖，改性壳聚糖在拉曼频移为1 300 cm-1时，拉曼光强为32 000左右，而未改性壳聚糖在拉曼频移为 1 300 cm-1 时，拉曼光强为18 000左右（图1）。拉曼散射光的强度并不是在所有方向上相等。影响2种壳聚糖拉曼峰强的因素有很多，晶体材料比非晶体材料有更强的拉曼峰，拉曼强度也会随键级而增强。

2.2X光衍射（X-ray diffraction）

X光衍射（X-ray diffraction），即X射线衍射。X光的波长范围为10-2～102 nm，与原子尺度接近。X光绕射广泛被用来探知物质内部的微结构，利用特性X光入射到结晶材料，在某些入射角材料的相邻结晶面散波彼此相位相同，且光程[CM（25]差为波长的整数倍，因此发生了建设性干涉。根据改性壳

[FK（W21][TPMJN1.tif]

聚糖与未改性壳聚糖结晶结构的不同，有所谓的空间群（space group）的区分，即使结构相同晶体内部原子组成不同，其结构因子（structure factor）不同，对于X光散射能力也不同。

X光衍射可以进行多物相成分的定性分析，壳聚糖的2种晶形分别称为FormI（2θ在32°左右）和FormII（2θ在20°左右），如图2所示，改性壳聚糖在32°有明显的衍射峰，表明原料壳聚糖粉末只有FormI一种晶体存在。当壳聚糖被改性后，改变了壳聚糖分子的结构，FormI晶形的衍射峰从20.0°迁移到32.8°，这表明伴随着壳聚糖改性，一种新的晶体逐步形成。

2.3用不同浓度的戊二醛溶液对2种固定化酶活性的影响

称取6份0.1 g 改性壳聚糖于小烧杯中，分别加入浓度为1%～6%的戊二醛溶液5.0 mL，充分搅拌3.5 h，置于离心机中3 000 r/min离心10 min进行分离，用蒸馏水洗涤2～3次以除去溶液中的戊二醛，往交联物中分别加入4.0 mL 1 g/L 的纤维素酶溶液，置于4 ℃冰箱中，1 h搅拌1次，持续24 h，3 000 r/min 离心5 min弃去上清液，水洗3次，得固定化酶。称取6份0.1 g 未改性壳聚糖作同样的处理。

固定化酶活性测定结果如图3所示，壳聚糖改性固化酶最适戊二醛交联浓度为3%，未改性壳聚糖固化酶最适戊二醛交联浓度为4%，当戊二醛的浓度达到3%时，改性固化酶的活力已达到最大。

[BT2+*5]2.42种固定化酶的最适pH值

准确配制pH值为3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6的 HAc/NaAc 缓冲液。吸取梯度缓冲液各1.5 mL，分别加入 15 mL 20 %的蔗糖溶液。与改性固定化酶反应时，先在固定化酶中加入1 mL蒸馏水，混匀后再将蔗糖溶液倒入纤维素酶中，30 ℃反应 5 min，壳聚糖固定化酶则用沸水浴反应 1 min 终止反应，4 000 r/min离心5 min，各管取反应液 0.5 mL，加入35 mL蒸馏水中，加入1 mL染色液，显色后测吸光度。结果如图4所示，改性壳聚糖固定化酶的最适pH值为4.3，而未改

性壳聚糖固定化酶的最适pH值为3.8。

2.5原酶、固定化酶与改性固定化酶米氏常数的比较

平行取固定化酶与改性固定化酶各0.1 g、原酶0.5 mL（1 g/L）各6份，分别与一定量（3.0 mL）不同浓度（1%～6%）的底物于40 ℃水浴中反应15 min，测其吸光度，用Linew eaver Burk双倒数法作图，求得米氏常数（Km）。结果如图5所示，原酶的Km值為7.3×10-3 g/L，未改性固化酶的Km值为 72×10-3 g/L，改性固化酶的Km值为3.7×10-3 g/L，壳聚糖被改性后，固定纤维素酶表现为米氏常数减小。

2.6温度对酶活性的影响

酶在固定化后，稳定性普遍增加，这主要表现在改性固定化酶的最适温度较原酶高，对热的稳定性也较原酶高。

平行取0.1 g固定化酶、0.1 g改性固定化酶和0.5 mL 1 g/L 的原酶各6份，分别在不同温度（30～80 ℃）条件下测定酶活性。如图6所示，未改性固化酶的最适温度为40 ℃，之后随着温度升高，曲线趋势较陡峭，酶的活性降低；当壳聚糖被改性后，使得酶的最适温度有所提升，改性固化酶活性的最适温度在55 ℃左右，相比未改性固化酶，改性固化酶对热的稳定性有所提高。

2.7改性壳聚糖、未改性壳聚糖固定化酶的稳定性

随着时间的推移，壳聚糖固化酶的稳定性由高变低，在 12～24 h固化酶的稳定性普遍较好，相比未改性固化酶，改性壳聚糖固化酶有更好的稳定性（图7）。

3讨论

大多数试验中均采用壳聚糖作吸附剂、戊二醛为交联剂固定化酶[2]，但采用化学方法改性壳聚糖固定化纤维素酶，却没有相关说明。通过试验改性壳聚糖，壳聚糖作为载体的性能得到了提高。

试验中发现当交联剂浓度为4%时，对改性固定化酶活性影响最大；改性壳聚糖固定化酶的最适pH值为4.3，未改性壳聚糖固定化酶的最适pH值为3.8；采用改性壳聚糖为载体的纤维素固化酶的米氏常数为3.7×10-3 g/L，未改性壳聚糖为载体的纤维素固化酶的米氏常数为7.2×10-3 g/L，将纤维素酶用改性壳聚糖固定后，改性固化酶最适温度在55 ℃左右，未

改性固化酶最适温度为40 ℃，通过试验对比改性固定化酶与未改性固定化酶发现，改性固定化酶热稳定性与贮藏稳定性更高。

壳聚糖与甲壳素作为自然界唯一的碱性多糖，来源广泛，更简单制备，对于其利用开发，对环境保护和资源开发有着一定的作用[9-13]。通过研究发现，将壳聚糖通过化学方法改性处理后，壳聚糖的分子结构产生了变化，性质也跟改性前大不相同，在戊二醛浓度对固定化酶活性影响的试验中，改性壳聚糖固定化酶的最适pH值高于未改性壳聚糖，固定化酶的活性也比未改性壳聚糖固定化酶的略高，在对温度的研究中，改性固定化酶比未改性固化酶的耐受温度更高，稳定性也更强。酶的活性容易受环境条件的影响，通过固定化，正好可以将纤维素酶的活性得以保留。

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