1株鲟源金黄杆菌的分离鉴定及药敏试验

孔杰++李小义+王艳艳+曾圣+周洲

摘要：为研究鲟鱼体内微生物多样性，从贵州省水产研究所惠水鲟鱼繁育基地采集鲟鱼进行微生物的分离培养，从肝脏中分离纯化获得1株优势菌株，命名为菌株Liver 5。经生理生化试验、菌体形态观察及16S rRNA序列分析，初步鉴定该菌为金黄杆菌（Chryseobacterium sp.）。人工感染试验表明，菌株Liver 5未引起鲟鱼发病死亡现象。药敏试验结果表明，菌株Liver 5对左氧氟沙星敏感，对新霉素、红霉素中度敏感，对氯霉素、青霉素-G、链霉素及头孢唑啉等21种抗生素均耐受。本研究结果对金黄杆菌引起的细菌性疾病用药治疗具有重要意义。

关键词：金黄杆菌；抗生素；生理生化；病原菌

中图分类号： S941.42文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0129-04

金黄杆菌属为革兰氏阴性、无鞭毛、严格好氧生长的一类菌属，广泛分布于水体和土壤中。脑膜脓毒金黄杆菌（Chryseobacterium meningosepticum）、产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）及黏金黄杆菌（Chryseobacterium gleum）等是引起人体发病的常见条件致病菌，可引起新生儿脑膜炎、败血症及呼吸道感染等疾病的发生[1]。部分金黄杆菌株还会造成鱼蟹和畜禽等养殖动物体感染发病[2-4]。但Krause在研究金黄杆菌对萝卜生长影响时发现，黏金黄杆菌对萝卜抵抗病原菌具有积极作用[5]。Ramos在拟南芥植物根际细菌对植物抗病效果研究中发现菌株Chryseobacterium balustinum AUR9能显著减少植株疾病发生[6]。近年来，金黄杆菌的产蛋白酶、抗氧化剂及生物防治剂等功效相继有所报道。王继元从无指盘臭蛙皮肤表面分离到1株产蛋白酶的金黄杆菌CW-E2T，并对其产胞外蛋白酶的特性进行了初步研究[7]。Kim等在研究金黄杆菌对植物病原菌拮抗机理中发现菌株Chryseobacterium wanjuense KJ9C8可通过产蛋白酶和HCN等物质对胡椒根际细菌菌群产生影响[8]。

鲟鱼为高蛋白、高脂肪性鱼类，是优良的淡水鱼品种，也是现存于世界上的最珍奇和最古老的冷水性生物鱼群之一，其肉厚骨软，同时鲟鱼卵可以加工成鲟鱼籽酱，具有“黑色黄金”之称。鱼体含有多种人体必需的氨基酸，具有很高的经济价值和药用价值。目前，对鲟鱼体内微生物多样性研究较少。本研究从贵州省水产研究所惠水鲟鱼繁育基地采集鲟鱼样品，对其体内微生物进行了分离鉴定。旨在为了解鲟鱼微生物多样性、筛选有益微生物及细菌性疾病治疗提供参考。

1材料与方法

1.1主要试剂

按常规方法自配LB（Luria-Bertani）固体培养基和水解酪蛋白琼脂（MH）培养基；细菌基因组DNA提取试剂盒、Taq DNApolymerase、dNTP等，购自TaKaRa公司；药敏试纸片、细菌生化微量鉴定管，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2样品采集与菌株分离

2014年7月于贵州省水产研究所惠水鲟鱼繁育基地采集鲟鱼；无菌条件下取鲟鱼肝脏，将肝脏组织在无菌生理盐水中研磨均匀，适当稀释后涂布在LB固体培养基上，28 ℃培养24 h，从中选取优势菌落进行纯化，直至获得纯培养物。

回归感染用的健康施氏鲟鱼也来自该基地，健康施氏鲟鱼放水族箱中暂养7 d，无异常后进行试验。

1.3菌株鉴定

菌株Liver 5生理生化反应鉴定方法参照文献[9]。

16S rRNA基因测序及系统发育分析：用细菌基因组DNA试剂盒提取单菌基因组DNA，扩增16S rRNA基因。16S rRNA基因正向扩增引物（位于E.coli 16S rRNA基因的第 8～27 个碱基位置）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向扩增引物（位于E.coli 16S rRNA基因的第1 512～1 493个碱基位置）：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′[10]。PCR扩增条件：95 ℃预变性5.0 min；94 ℃变性1.0 min，55 ℃復性1.0 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；最后72 ℃，温育 10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳确定条带后交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。

1.4鲟鱼人工感染试验

选取健康的鲟鱼进行人工注射感染试验。菌株Liver 5过夜培养，取对数期菌液，离心收集菌体，用无菌PBS溶液洗涤2～3次，制备成菌悬液。腹腔注射菌浓度为9×108 CFU/mL，同时设置注射PBS液体的为对照组。取30尾体长为10～12 cm的鲟鱼，每尾注射100 μL菌悬液。室温下养殖连续养殖11 d，试验期间持续充氧。每天观察记录各组鲟鱼死亡情况。

1.5菌株Liver 5药敏试验

抗生素敏感试验采用纸片法。将菌悬液均匀涂布在LB固体培养基表面，贴上抗生素试纸，28 ℃培养24 h，检测记录形成的敏感圈大小，以此判断待测菌株对各种抗生素的敏感程度。试验抗生素包括：头孢噻肟、卡那霉素、羧苄青霉素、四环素、多黏菌素B、强力霉素、环丙沙星、阿莫西林、麦迪霉素、链霉素、头孢唑啉、头孢曲松、新生霉素、阿米卡星、克林霉素、左氧氟沙星、庆大霉素、青霉素G、阿奇霉素、呋喃唑酮、妥布霉素、氨苄西林、新霉素、红霉素、氯霉素。

2结果与分析

从贵州省水产研究所惠水鲟鱼繁育基地采集鲟鱼样品，取其肝脏组织进行富集、分离和筛选，获得1株优势菌株，命名为菌株Liver 5。以下试验均以菌株Liver 5为试验材料。

2.1菌株Liver 5的生理生化鉴定

对菌株Liver 5生理生化的各项指标进行检测。由表1可知，在LB培养基上生长24 h菌株Liver 5菌落形态为圆形，边缘整齐，中间微隆，表面光滑且有光泽、金黄色，不透明。革兰氏染色观察显示，菌株Liver 5为革兰氏阴性菌，短杆状。氧化酶、接触酶呈阳性，能水解利用淀粉、木糖、葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸等，但不能利用纤维素、棉籽山梨醇及尿素等。

2.2菌株Liver 5系统进化分析

提取菌株Liver 5总DNA，经16S rRNA基因序列扩增测序得到1 167 bp片段的DNA序列，将所得序列在EZTaxon上进行序列比对，结果显示菌株Liver 5与Chryseobacterium oncorhynchi 701B-08T相似性最高，为98.89%，其次为Chryseobacterium viscerum 687B-08T（98.32%）、Chryseobacterium artocarpi UTM-3T（97.79%）、Chryseobacterium jejuense JS17-8T（97.73%）等。结合其生理生化特性，初步鉴定其为金黄杆菌（Chryseobacterium sp.）。采用MEGA 6.0分析软件构建系统发育树（图1）。

2.3鲟鱼人工感染试验

选取健康的鲟鱼，检验菌株Liver 5对其的致病性。腹腔注射感染11 d，鲟鱼无发病或死亡现象，表明菌株Liver 5对鲟鱼无致病性。

2.4抗生素敏感性试验

通过纸片法检测了菌株Liver 5对24种抗生素的敏感性，结果发现菌株Liver 5对左氧氟沙星敏感，对新霉素、红霉素[CM（25]中度敏感，对氯霉素、青霉素-G、链霉素及头孢唑啉等种抗生素均耐受（表2）。

3讨论

目前，对金黄杆菌属的研究多集中于其致病性方面。王世瑜等对分离获得的172株产吲哚金黄杆菌抗药性及临床分布进行了分析，发现该菌表现出了多重耐药性，且以呼吸道感染为主[15]。何树光对216株金黄杆菌属耐药性分析结果表明，头孢哌酮/舒巴坦对治疗金黄杆菌属细菌引起的感染具有较好效果[16]。此外，金黄杆菌在其他动植物的分布及致病性也有较多的研究。养殖欧洲鳗鲡鳃部金黄杆菌属所占比例较高，为28.3%[17]。胡文举等从产后1、8、15、22 d牛的子宫中均分离得到产吲哚金黄杆菌，其中产后1 d产吲哚金黄杆菌所占比例较高，为14.29%，仅次于藤黄微球菌所占比列（15.71%）[2]。棘胸蛙歪头病死亡率高，其典型症状为歪头，李明等对浙江丽水发病棘胸蛙致病菌进行分离鉴定，发现脑膜炎败血金黄杆菌（Chryseobacterium meningosepticum）是引起该病发生的致病菌，人工感染试验4 d致死率达到100%，表明该菌株对棘胸蛙具有较强的致病性[18]。2014年重庆地区部分棘胸蛙养殖场出现棘胸蛙出血死亡的病例，吴宝红等经研究发现致病菌为金黄杆菌[19]。通过生理生化鉴定及16S rRNA序列分析，初步鉴定菌株Liver 5为金黄杆菌（Chryseobacterium sp.）。鉴于金黄杆菌引起的养殖动物疾病时有发生，本研究对分离获得的金黄杆菌Liver 5进行了鲟鱼人工感染研究。人工注射感染试验表明，菌株Liver 5对鲟鱼无致病性。

随着鲟鱼养殖业的快速发展，集约化养殖规模扩大，各种疾病不断出现，消毒剂和抗生素等传统的疾病防治方法不能有效地预防疾病发生，同时随着耐药菌株及抗生素对人体危害等问题的发生，多个国家对抗生素药物作为饲料添加剂均有限制，抗生素的应用也越来越受到重视。因此，在细菌性疾病暴发时，选择针对性强的抗生素适量使用可以达到控制疾病进一步暴发并减少抗生素滥用的目的。研究表明，金黄杆菌对头孢菌素类、氨基糖苷类、碳青霉烯类等抗生素耐受性较强[20]。本试验选择24种抗生素对菌株Liver 5的敏感性进行研究，[JP3]结果表明菌株Liver 5对左氧氟沙星敏感，对新霉素、红霉素中度敏感，可为金黄杆菌致病菌引发疾病用药选择提供参考。

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