云南松毛虫肠道中产脂肪酶菌的研究

安曼云 焦丽丽 伊炜 崔立华

摘要：采用微生物筛选培养和酶学方法，研究了云南松毛虫肠道内产脂肪酶菌群及产酶特性，为松毛虫的综合开发利用提供理论依据。结果表明，从云南松毛虫幼虫肠道内共分离筛选获得193株产脂肪酶的菌株，涉及3个菌属：82株假单胞菌属（Pseudomonas）、67株芽孢杆菌属（Bacillus）和44株克雷伯氏菌属（Klebsiella）；其中，假单胞菌属为优势菌群，占总菌株数量的42.49%；供试的9株菌株表现出不同的产脂肪酶活性，并从中筛选得到了1株高产脂肪酶菌株P-50，最适作用温度为35 ℃，pH值为8，经发酵至60 h时生长量达到最大，在48 h左右时酶活性达到最高；P-50初步确定为中温产碱性脂肪酶菌。

关键词：云南松毛虫；产脂肪酶菌；酶活性；假单胞菌属

中图分类号： Q814文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0093-03

近年來，随着胃肠道微生态理论的深入研究，有关昆虫肠道微生物的研究已成为新热点[1-2]。脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，广泛存在于动植物组织微生物体中，其中发现能产脂肪酶的细菌约有28个属[3-4]。目前，已在多种昆虫肠道中发现各类产酶菌群，并对酶学性质进行了研究，昆虫肠道中存在不同功能的菌群[5-8]。由于微生物脂肪酶作用的温度和pH值范围比动植物脂肪酶的更宽，易获得较高纯度酶制剂，适合于工业上大规模生产[9-10]。因此，不断筛选出具有新特性和高活性的脂肪酶是一项非常有意义的工作。

云南松毛虫（Dendrolimus houi Lajonquiere）属鳞翅目（Lepidoptera）枯叶蛾科（Lasiocampidae），是林业的重大害虫之一，但是从营养学和资源学的角度来看，它又具有极大的开发利用价值[11-12]。目前国内外对松毛虫的研究主要集中在防治方面，且在相关产酶微生物资源研究时，多从土壤、淤泥中分离筛选，但对松毛虫的利用以及肠道微生物的研究报道较少[13]。由于松毛虫长期食用多种松类针叶，对松油脂有着特殊的消化体系，可能肠道内存在着特殊的微生物菌群资源[14-15]。因此，本研究拟以云南松毛虫为试验材料，研究松毛虫肠道内产脂肪酶菌株及酶学特性，为松毛虫的综合利用及产脂肪酶微生物新资源的开发提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1云南松毛虫

采自云南省楚雄州永仁县云南松母树林，共计60只幼虫。

1.1.2培养基

试验培养基名称及配方[16]。分离培养基：肉膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂15.0 g/L，pH值=7.0；脂肪酶筛选培养基：牛肉膏5.0 g/L、蛋白胨 10.0 g/L、橄榄油20.0 mL、琼脂15.0 g/L，pH值=7.0；活化培养基：牛肉膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、橄榄油20.0 mL、琼脂15.0 g/L，pH值=7.0；高产脂肪酶菌株筛选培养液：酵母膏5.0 g/L、（NH4）2SO4 5.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、橄榄油20.0 mL、云南松节油 20 mL，pH值=7.0；发酵培养基：酵母膏5.0 g/L、（NH4）2SO4 5.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、云南松节油20 mL，pH值=8.0。

1.2试验方法

1.2.1产脂肪酶菌株的分离筛选及分子鉴定

用无菌水饲养云南松毛虫1 d后，解剖虫体取其肠道，经研磨、稀释后涂布于分离培养基上，37 ℃培养48 h。挑取形态各异的纯菌落接种到脂肪酶筛选培养基进行培养，筛选能产生透明圈的菌株。对菌株进行DNA提取[细菌DNA提取试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司]，采用16S rDNA通用引物进行16S rDNA序列的扩增和测序分析。计算分离率及分离频率。

[JZ]分离频率=a/b×100%。

式中：a为分离到的某一指定类型真菌的菌株数量，株；b为分离的真菌菌株数量，株。

[JZ]分离率=a/c×100%。

式中：a为分离到的某一指定类型真菌的菌株数量，株；c为分离样品总数，60只。

1.2.2高产脂肪酶菌株筛选

从假单胞菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌3个菌属中分别选取3株供试菌株筛选高产脂肪酶，分别为P-13、P-50、P-106；P-03、P-19、P-154；P-06、P-28、P-67。将这9株供试菌株分别接种于高产脂肪酶菌株筛选培养液中培养（以云南松节油为底物，橄榄油作对照底物），48 h后测定脂肪酶活性（采用醋酸铜比色法[17]）。

1.2.3高产菌株酶解特性、生长量、产酶特性确定

设置5个反应温度梯度（25、30、35、40、45 ℃）和5个pH值梯度（50、6.0、7.0、8.0、9.0）测定酶活性，确定最适温度以及在最适温度下的最适pH值。将高产脂肪酶菌株接种于发酵培养液中继续培养，24 h后每隔12 h测定菌株生长量及酶活性。

2结果与分析

2.1云南松毛虫肠道中产脂肪酶菌株的筛选

从云南松毛虫幼虫肠道内共分离筛选获得193株产脂肪酶的菌株，涉及3个菌属：82株假单胞菌属（Pseudomonas）、67株芽孢杆菌属（Bacillus）和44株克雷伯氏菌属（Klebsiella）（表1）。产脂酶菌在云南松毛虫肠道中的分离率较高，最低的为73.33%，说明云南松毛虫肠道中存在有大量的产脂酶菌群。在这3个菌属中，假单胞菌属为优势菌群，占总菌株数量的42.49%；克雷伯氏菌属最少，为22.80%。

2.2云南松毛虫肠道中高产脂肪酶菌株的筛选

9株产脂肪酶菌株对橄榄油和云南松节油2种底物的水解活性不同。由图1可知，当以松节油为底物时的酶活性大于对照橄榄油为底物时的酶活性（菌株P-154除外），菌株 P-154的酶活性表现最低，而且偏向于底物橄榄油。以松节油为底物时，云南松毛虫肠道中产脂肪酶菌群的酶活性表现为假单胞菌属（酶活性平均值4.80 U/mL）>克雷伯氏菌属（2.94 U/mL）>芽孢杆菌属（2.65 U/mL），其中假单胞菌属中菌株P-50的酶活性最大，为5.06 U/mL，初步确定为高产脂肪酶菌株。

2.3高产脂肪酶菌株酶学性质分析

由图2可知，P-50的最适宜温度为35 ℃，其酶活性达4.7 U/mL（图2-a）。在最适温度35 ℃条件下，P-50的最适pH值为8时，酶活性达到最大值（图2-b），说明菌株 P-50 为中温产碱性脂肪酶菌。

2.4高产脂肪酶菌株生长及产酶特性

以D600 nm值来衡量菌株P-50的生长量，P-50的生长量是随着培养时间的延长而增加，当培养60 h左右时，生长量达到最大值，随后不再增加（图3-a）。而在P-50生长对数时期，培养48 h时P-50表现出较高的酶活性，为 5.8 U/mL，随后缓慢下降（图3-b）。

3结论与讨论

昆虫肠道中蕴含丰富的微生物资源，从中筛选出具有新特性和高活性的脂肪酶是一项非常有意义的工作。本研究首次从云南松毛虫幼虫肠道内共分离获得193株产脂肪酶的菌株，涉及3个菌属：假单胞菌属、芽孢杆菌属和克雷伯氏菌属，其中假单胞菌属为优势菌群，占总菌株数量的42.49%。结果表明，长期寄生于松毛虫肠道中的产脂酶菌群种类丰富多样，为脂肪酶菌资源的开发利用提供了新的来源途径。目前，生产上常见的产脂肪酶菌株主要有假单胞菌属、芽孢杆菌属、

[FL（2K2]无色杆菌属（Photorhabdus）、色杆菌属（Chromobacterium）和产碱菌属（Alcaligenes）5个菌属[3]。本研究中分离的假单胞菌属和芽胞杆菌属为常见菌属，已在多种昆虫[桑天牛（Apripona germari）、白蚁（Tsaitermes ampliceps）、蝗虫（Atractomorpha sinensis）]中分离获得，但分离得到的克雷伯氏菌属的菌株研究还较少，有待进一步研究。

云南松毛虫肠道中产脂肪酶菌群的酶活性表现不同，从中筛选得到了1株高产脂肪酶菌株P-50，属于假单胞菌属。以松节油为专一底物时，该菌株表现出较高的脂肪酶活性，并初步确定为中温产碱性脂肪酶菌（最适作用温度为35 ℃，最适pH值为8）这与鳞翅目昆虫碱性肠道（pH值为8.0～100）环境相关联。然而，P-50与已有高产酶菌株的酶活性相比还有很大的差距，有待进一步研究。

参考文献：

[1]郭军，吴杰，邓先余，等. 昆虫肠道菌群的功能研究进展[J]. 应用昆虫学报，2015，52（6）：1345-1352.

[2]黄云，詹先进，蓝家样，等. 昆虫肠道微生物的研究进展[J]. 湖北农业科学，2009，48（11）：2888-2890.

[3]Hasan F，Shah A A，Hameed A. Industrial applications of microbial lipases[J]. Enzyme and Microbial Technology，2006，39（2）：235-251.

[4]刘虹蕾，缪铭，江波，等. 微生物脂肪酶的研究与应用[J]. 食品工业科技，2012，33（12）：376-381.

[5]袁秀洁. 桑天牛成虫肠道优势细菌菌群研究[D]. 保定：河北农业大学，2010.

[6]袁志辉，蓝希钳，杨廷. 家蚕肠道细菌群体调查与分析[J]. 微生物学报，2006，46（2）：285-291.

[7]刘航. 白蚁和蝗虫肠道共生细菌群落结构研究[D]. 郑州：河南农业大学，2012.

[8]Ashida H，Ogawa M，Kim M，et al. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier[J]. Nature Chemical Biology，2012，8（1）：36-45.[HJ1.6mm]

[9]Anuradha P，Rani D J，Vijayalakshmi K，et al. Pasha microbial lipases：a potential tool for industrial applications[J]. Journal of Pure and Applied Microbiology，2009，3（1）：301-306.

[10]董明奇，史岩，姜春雷，等. 脂肪酶高产菌株的筛选及酶学特性研究[J]. 四川大学学报（自然科学版），2008，45（4）：985-990.

[11]劉高强，魏美才，王晓玲. 松毛虫资源开发及其资源化管理的初步设想[J]. 西北林学院学报，2004，19（4）：119-122.

[12]许国莲. 云南省云南松毛虫研究进展[J]. 西南林业大学学报，2008，28（3）：42-44.

[13]刘湘早. 云南松毛虫生物学特性及综合治理[J]. 西南林业大学学报，2006，26（3）：52-54.

[14]孙佑赫，周开艳，熊智. 云南松毛虫肠道产纤维素酶菌株的筛选鉴定及酶学性质[J]. 华北农学报，2012，27（增刊1）：254-258.

[15]王金华，李彪，张武先，等. 五龄恩茅松毛虫幼虫的肠道好氧细菌多样性分析[J]. 应用昆虫学报，2013，50（1）：230-234.

[16]黄晶，袁丽红，孙镇. 脂解麻疯树油脂肪酶产生菌的筛选鉴定及其催化特性[J]. 微生物学报，2011，51（4）：488-494.

[17]江慧芳，王雅琴，刘春国. 三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进[J]. 化学与生物工程，2007，24（8）：72-75.