田七炭疽病病原的分离与鉴定

韦荣昌 唐其 白隆华

摘要：炭疽病是田七生长发育过程中一种严重的病害，为明确引起炭疽病的病因，从引起田七叶片穿孔和褐化的样本上分离病原，对病原进行致病性测定，对显微形态和rDNA ITS分子进行鉴定。结果表明，2种田七炭疽病病原分别为人参炭疽菌（Colletotrichum panacicola）和胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

关键词：田七；炭疽病；人参炭疽菌；胶孢炭疽菌；病原鉴定；发生规律；病害防治

中图分类号： S435.675文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0086-03

田七[Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen]别称三七、山漆、金不换、南方神草等，为五加科（Araliceae）人参属（Panax）多年生草本植物，主要以根和根茎入药[1]。田七为我国著名的传统中药，是人参属植物中皂苷类分子多样性最丰富、含量最高、最有医疗保健价值以及最具有开发利用前景的药材[2]，在中枢神经系统、血液系统、心脑血管系统以及免疫系统等方面具有较好的生理活性[3-7]，广泛应用于药品、食品、保健品和化妆品中。然而，由于独特的生态环境及严重的连作障碍，导致田七病害发生种类多、发病重[8]。2014—2015年，笔者在广西壮族自治区南宁市各地田七病害的田间调查中发现了造成田七叶片穿孔和褐化的2种病害，导致叶片大量脱落，严重影响药材的质量和产量。本研究通过病原分离和鉴定，确认人参炭疽菌（Colletotrichum panacicola）和胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）侵染田七是造成其叶片穿孔和褐化的主要原因，为进一步系统研究该病的发生规律及其病害防控提供参考。

1材料与方法

1.1标本来源及症状描述

标本来源于广西药用植物园田七种植基地，通过田间自然感病和人工接种发病叶片进行症状描述。

1.2病原菌的分离纯化及致病性测定

选取染病田七叶片，在病健结合组织处切取0.5 cm小块，依次用75%乙醇浸泡30 s，0.1%氯化汞消毒2 min，灭菌水漂洗3～5次，置于PSA培养基上26 ℃恒温培养，待菌丝长出后挑取菌落的边缘进行纯化，通过单孢分离纯化后的菌落，得到纯培养分离物。待分离获得的菌株经单孢纯化后，保存于PSA培养基斜面上，置于4 ℃冰箱中贮存，备用。

依据针刺接种法进行病原菌致病性测定，在健康的田七叶片上接种纯培养的分离物（菌丝块），置于26 ℃的恒温培养箱内保湿培养，3次重复，以未接种的健康田七叶片作对照，定期观察叶片的发病情况。对接种发病的叶片进行病原菌再分离，观察分离得到的病原菌是否与接种菌株相同。

1.3形态学鉴定

对PSA平板上的病原菌菌落特征及产孢情况进行观察分析，同时对分生孢子进行革兰氏染色，显微测定分生孢子盘、分生孢子梗长以及分生孢子的大小。

1.4分子生物学鉴定

1.4.1DNA提取

采用易润华等的方法[9]，用DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取病原菌基因组DNA。

[CM（26]1.4.2rDNA ITS区的扩增及测序

以ITS1（5′-TCCGTAG[CM）][LM]GTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）为引物，PCR扩增菌株的rDNA ITS序列。反应体系：10×Ex Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L Primer ITS1 2 μL，10 μmol/L ITS54 2 μL，Genomic DNA 20 ng，5 U/μL Ex Taq 0.5 μL；ddH2O补足至50 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 复性80 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

用琼脂糖凝胶电泳扩增PCR产物，回收目标DNA片段，送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化测序。通过BioEdit校对测序结果，进行序列拼接，把拼接好的系列與GenBank数据库中的序列进行Blast相似性比对，选取同源性较高的序列，利用MEGA 5.05软件的Neighbor-Jorning法构建系统发育树。

2结果与分析

2.1病害症状

标本1，叶片染病初生圆形或近圆形黄褐色病斑，中间呈灰褐色至灰色，边缘黄色晕圈明显，后期病部易破裂穿孔，病斑较小，直径2～5 mm（图1）。标本2，病菌主要从叶缘侵入，在叶片上形成半圆形或“V”形病斑，有轮纹，中间呈红褐色至灰褐色，后期具有黑色小点，周围有黄晕，病斑较大，直径8～15 mm（图1）。

2.2致病性测定

接种叶片表现出与自然病叶相同的症状，未接种叶片表现正常，从回接发病田七叶片上可以100%得到原接种病菌。

2.3形态学鉴定

在PSA平板上，病原菌tg-1菌落圆形，边缘整齐，气生菌丝初为白色，后渐变为浅黄褐色，菌丝毛绒状，不会形成分生孢子盘；分生孢子为单胞、无色，呈长椭圆形或棍棒状，大小为（6.0～16.0）μm×（2.5～5.5）μm，平均为12.0 μm×4.0 μm（图1）。

在PSA平板上，病原菌hb-2菌落圆形，边缘整齐，气生菌丝初为白色，后渐变为灰白色或深灰色，菌丝棉絮状；分生孢子盘呈黄褐色垫状突起，圆形，直径（85.0～210.0） μm，无刚毛；分生孢子梗短，略呈倒棒状，（8.0～11.0）μm×（3.0～4.0）μm；分生孢子单胞，无色，长椭圆形，两头钝圆或一端稍尖，大小为（9.0～13.0）μm×（3.0～5.0）μm，平均为 11.0 μm×4.0 μm（图1）。

2.4分子生物学鉴定

使用真菌ITS区域的引物ITS1和ITS4，对病原菌tg-1、hb-2进行扩增，分别获得大小为568、556 bp的片段。将扩增产物测序所得的序列拼接后与GenBank中核酸数据进行Blast比对分析，结果发现，tg-1与已报道的多个人参炭疽菌的序列同源性最高，相似性达99%；从系统发育树也可以看出，tg-1与人参炭疽菌的遗传距离最近（图2）；hb-2与多个胶孢炭疽菌的序列同源性最高，相似性达100%。系统发育树也表明，hb-2与多个胶孢炭疽菌的遗传距离最近（图2）。参照文献[10-11]，结合病原菌形态学及分子生物学鉴定结果，分别将病原菌tg-1、hb-2鉴定为人参炭疽菌和胶孢炭疽菌。

3讨论与结论

近年来，随着广西壮族自治区政府“田七回家”扶贫项目的启动，众多农民选择种植田七脱贫致富，然而田七炭疽病的发生，严重影响田七产业的健康发展和农民的增收。作为世界上分布最广的植物病原菌之一，炭疽菌在致病性、寄主特异性和遗传同质性等方面可分为多种亚组，属多形态种[12]，且其分生孢子形态多相似。因此，单从形态学鉴定菌种显得尤为困难，须要借助分子生物学加以鉴定[13]。就进化速度来说，rDNA ITS区域比编码区快，可以提供更多变异来进行种间或种内的分子系统研究。本研究根据形态学特征和分子生物[CM（25]学分析结果，将引起田七叶片穿孔和褐化的田七炭疽病病[CM）][FL）]

原菌鉴定为人参炭疽菌或胶孢炭疽菌，但有关该病害的发生流行规律、侵染循环、防治措施以及抗性品种的选育有待进一步研究。

rDNA ITS序列测定是当前常用的植物病原分子鉴定方法，然而本研究中病原菌tg-1的rDNA ITS序列既与人参炭疽菌的对应序列具有99%的同源性，也与希金斯炭疽菌（C. higginsianum）99%同源，单靠分子生物学的方法难以鉴定，说明rDNA ITS序列在炭疽病菌（或其他病菌）的鉴定中还存在一定的局限性，须要与形态学特征等传统鉴定方法相结合才能更好地进行病原鉴定。

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江苏农业科学2017年第45卷第10期

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