苹果树皮内生菌对苹果树腐烂病的防治效果

尹宝重 刘博燕 刘盼 张月辰��

摘要：从苹果树皮中分离出1株对苹果腐烂病病菌具有较好拮抗作用的内生细菌——B5014。该菌株对腐烂病病菌的抑菌率达55.59%，显著高于其他菌株；通过对菌株B5014发酵滤液进行不同浓度稀释后发现，随着浓度的不断降低，菌株B5014发酵滤液对腐烂病病菌菌丝生长、孢子萌发的抑制率不断下降；田间试验表明，在接种时间较短（10 d）时，B5014细菌悬浮液原液处理可以与生产中常规使用的80%代森锰锌800倍液防效基本持平，但到接种20 d时，防效低于常规化学防治方法。

关键词：苹果树；腐烂病；内生细菌；防效

中图分类号： S436.611.1+1文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0084-02

河北省是我国最重要的苹果产区之一，苹果树种植已是当地农业的主导产业之一。近年来，随着气候、环境、生产方式的变化，苹果腐烂病在河北省苹果种植区发生日趋严重，已经严重影响到当地苹果产业的健康持续发展[1]。现阶段苹果腐烂病的防治主要以化学防治为主，不但污染环境，而且容易引起农药残留超标，影响果实品质。再加上很多地方对腐烂病的防治并没有统一的规范，随意加大药量和用药频率的问题突出，导致病原菌抗药性增强，形成恶性循环。因此，筛选经济高效、环境友好的拮抗菌，对进一步促进“低毒高效”的苹果腐烂病防控模式的构建，推进河北省草莓产业良性、健康发展都具有重要意义。

有关苹果腐烂病菌拮抗菌的筛选研究，前人进行过一些。比如，高克祥研究表明，内生螺旋毛壳菌ND35产生的抗生素能有效抑制苹果树腐烂病病菌的生长，且它产生的发酵液有助于愈伤组织的形成[2]；原犇犇也证明，灰色链霉菌的1个变种对苹果树腐烂病病菌菌丝生长有抑制作用[3]；展丽然提出，某些土壤中有一种放线菌，对腐烂病病菌具有拮抗作用[4]。类似的研究还有很多，但这些技术的筛选过程都比较长，而且拮抗效果往往不够稳定。内生真菌作为普遍存在于寄主植物中的真菌，能产生多种活性物质，可以起到抵御外来病原菌入侵的作用。本研究拟通过组织分离法和平板对峙试验从苹果树皮中分离和筛选内生细菌，研究其对苹果树腐烂病病菌的抑菌作用，为苹果腐烂病生物防治技术的进一步优化提供新的参考。

1材料与方法

[HTK]1.1供试材料[HT]

（1）供试病原菌：苹果腐烂病病菌，由河北农业大学植物病理生态学实验室提供。

（2）供试植物材料：于2015年12月，从山东省烟台市、河北省石家庄市、甘肃省庆阳市等地选择100株10～15年生，腐烂病发生严重的植株，在它们健康的主干、主枝、侧枝、小枝、木质部等部位的树皮上采集获得。苹果品种为富士。

1.2试验设计与方法

1.2.1内生细菌的分离与筛选

采用组织分离方法[5]，将采集的树皮用水洗净，剪至0.2 cm2左右，用75%乙醇、4%次氯酸钠充分消毒后，无菌水清洗。将彻底消毒的树皮研磨成匀浆，无菌水稀释，均匀涂抹在PDA培养基平面上，长出菌落后采用划线法纯化培养。将纯化后获得的菌株采用对峙培养法对内生细菌进行筛选，将打好的直径为4 mm的苹果树腐烂病病菌菌饼放于PDA平板2侧，用接菌环蘸取待测细菌悬浮液在平板中央划线，放于培养箱中27 ℃黑暗培养4 d。统计抑菌带宽度，选取抑菌带最宽的5种细菌，分别测量病原菌向拮抗菌方向生长的长度和对照中病原菌生长的半径，以抑制率表示拮抗作用，选取抑制率最高的细菌进行室内和田间生物测定。抑制率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径]×100%。

1.2.2B5014菌株对苹果树腐烂病病菌的抑菌效果

发酵滤液对苹果树腐烂病病菌菌丝生长的抑制效果：挑取B5014接入NB液体培养基中，30 ℃摇床培养24 h（浓度约为8×109 CFU/mL），5 000 r、20 min离心2次，收集上清液去除杂菌，得无菌滤液。在48 ℃下，将无菌发酵滤液混入灭菌PDA培养基中，混匀后倒平板。平板中央接种苹果树腐烂病病菌菌饼，27 ℃培养48 h后测量菌落直径。PDA培养基中，无菌滤液的最终稀释倍数分别为20、100、200、1 000倍，以加灭菌蒸馏水的处理为对照[6-7]。发酵滤液对苹果树腐烂病病菌分生孢子萌发的抑制效果：取20 μL病原菌分生孢子悬浮液置于无菌载玻片上，再量取20 μL上述过滤液滴入载玻片上的分生孢子悬浮液滴中[8]。保湿条件下25 ℃静置，分别于5、13 h后，以PD培养液作为对照，观察病原菌分生孢子萌发情况。每个处理4次重复，每个重复3次试验。

1.2.3田间防效试验

试验于2012年5月10日在河北省保定市河北农业大学苹果试验基地进行，供试树种为红富士，树龄8年，株行距3 m×4 m。土壤pH值为7.2，有机质含量为1.28%，水肥条件良好。选取其中10年生、长势相近的苹果树，在主枝上用6 mm打孔器打孔并接种旺盛生长的链格孢属内生真菌菌饼，用保鲜膜包裹保湿，3 d后去掉菌饼，再接种腐烂病菌菌饼，保湿1周后去掉保鲜膜，记作处理A；以80%代森锰锌800倍液作为对照处理，在接种腐烂病菌菌柄的部位涂抹80%代森锰锌800倍液，用量为20 mL/m2，记作处理B；以不接内生真菌的处理为空白对照（CK），每个处理3次重复，每个重复8棵树。记录苹果树腐烂病的发生情况，统计发病率和病斑面积。发病率=病株数/总株数×100%；病斑面积=1/4×π×长径×短径。

2結果与分析

2.1内生细菌的分离与筛选

通过对峙试验的筛选，共获得125株细菌，其中抑制率较高的有7种，所选的7种抑菌效果较好菌株的抑菌带宽度均在12 mm以上（表1）。其中，抑菌带最宽的是B5014，达 16.4 mm，显著高于其他菌株。菌株B5014菌落半径仅为131 mm，显著低于其他菌株。从抑制率来看，所选7个菌株的抑制率均超过了40%，其中菌株B5014最高，达5559%，且在0.05水平上显著高于其他菌株。

2.2内生细菌B5014对苹果树腐烂病病菌的抑菌效果

由表2可知，B5014发酵滤液对苹果树腐烂病病菌菌丝生长和孢子萌发具有明显的抑制效果，且这种抑制效果随着发酵滤液浓度的降低而降低。从B5014不同浓度发酵滤液对苹果树腐烂病病菌菌丝抑制情况来看，随着发酵滤液浓度降低，腐烂病病菌菌落直径不断增大，到稀释500倍时，其菌落直径已达到23.1 mm，与对照差异不显著；稀释20倍时，B5014发酵滤液对腐烂病病菌菌丝抑制率最高，达 85.1%，显著高于其他浓度梯度。从B5014不同浓度发酵滤液对苹果树腐烂病孢子萌发情况来看，稀释500倍时，发酵滤液对病原菌孢子的抑制作用已经很弱，孢子萌发率已经达到618%，与对照无显著差异。发酵液稀释20倍时，对病原菌孢子的抑制作用非常强，抑制率为100%，显著高于其他处理。

2.3内生细菌B5014防治苹果树腐烂病的田间试验结果

表3是内生细菌B5014防治苹果树腐烂病的田间药效试验结果。由表3可知，在2个时间段的观测中，B5014细菌悬浮液原液处理的病斑面积均显著低于空白对照，且接种腐烂病菌10 d时与80%代森锰锌800倍液处理差异不显著。从防效来看，在接种腐烂病菌10、20 d时，B5014细菌悬浮液原液处理的防效分别可达79.4%、77.5%。由此可知，在接种时间较短的时候，B5014细菌悬浮液原液处理可以与生产中常规使用的80%代森锰锌800倍液防效基本持平，但随着病菌接种时间的延长，防效则低于常规化学防治方法。[FL）]

3结论与讨论

苹果树腐烂病是目前苹果生产中非常严重的病害之一，针对腐烂病的防治问题也一直属于苹果生产中的热点问题。但由于目前生产中大量采用化学方法进行防治，导致果实中农药残留高，环境也因此受到很大影响。所以，开发一些环境友好型的技术、方法就成为目前苹果树腐烂病防治中的重要研究方向。本研究在苹果树皮中筛选出对苹果树腐烂病具有较好拮抗效果的内生细菌B5014，经过对它的发酵滤液进行不同浓度梯度稀释后发现，不同稀释倍数的发酵滤液对腐烂病病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用有显著差异。这为进一步研究该菌株的抑菌机制及作相关鉴定都提供了一定的参考。同时，田间试验也表明，应用B5014细菌悬浮液，對苹果树腐烂病的防效比生产中常规使用的80%代森锰锌800倍液要低一些。推测这可能与未将B5014菌株加工成剂型，影响其功能的有效发挥有关。因此，接下来将进一步对B5014的发酵工艺进行优化，以使其更好地在苹果树腐烂病防治中发挥功效。

参考文献：

[1]贾世隆. 陇东苹果生产中存在的问题及可持续发展对策[J]. 甘肃农业科技，2002（2）：23-24.

[2]高克祥. 内生真菌Chaetomium spirale、Stagonospora sp. 与病原菌、寄主植物相互作用的机制[D]. 杨凌：西北农林科技大学，2005.

[3]原犇犇. 几种林木病原菌拮抗放线菌的筛选及其活性物质研究[D]. 杨凌：西北农林科技大学，2007.

[4]展丽然. 苹果腐烂病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及发酵条件的优化[D]. 保定：河北农业大学，2008.

[5]黄海东，杨红澎，王玉，等. 云雾龙胆内生菌的分离鉴定及抗菌活性分析[J].微生物学通报，2010，37（7）：1017-1021.

[6]Xin Y F，Shang J J. Bio-control trials of Chaetomium spirale ND35 against apple canker[J]. Journal of Forestry Research，2005，16（2）：121-124.

[7]王磊，郜佐鹏，黄丽丽，等. 防治苹果腐烂病杀菌剂的室内筛选[J]. 植物病理学报，2009，39（5）：549-554.

[8]张淑颖，曲田丽，孙阳，等. 剑麻内生细菌JM-3对苹果腐烂病抑制作用的研究[J]. 华北农学报，2013，28（4）：208-213.