仔猪蓝耳病病毒、圆环病毒和链球菌混合感染的诊断

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

仔猪蓝耳病病毒、圆环病毒和链球菌混合感染的诊断

马莉莉，王宇婷，倪宏波*

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

为诊断黑龙江省某猪场暴发的猪病，采用流行病学调查、临床检查和病理剖检以及实验室检测技术，通过PCR检测、革兰氏染色、生化试验等方法对无菌采集的病料进行检测。PCR检测结果显示猪圆环病毒和蓝耳病病毒为核酸阳性条带，革兰氏染色和生化试验结果为链球菌，最终证明该群病猪为圆环病毒、蓝耳病病毒和链球菌混合感染。本文提出了一些预防保护措施，也为猪圆环病毒病和蓝耳病的防治提供了参考。

圆环病毒；蓝耳病毒；链球菌；混合感染

猪圆环病毒(Porcinecircovirus )是一种无囊膜的DNA病毒，圆环病毒属成员。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性病毒；PCV2为致病性病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）的主要病原[1]。PMWS最早确认是由PCV2感染所致的疾病，常见PMWS主要发生在5～16周龄的猪，常见于6～8周龄猪，极少感染乳猪。一般断奶后2～3 d发病，急性发病猪群病死率可达10%，但常由于并发细菌或病毒感染而增加死亡率，病死率可达25%以上[2]。猪蓝耳病病毒（PRRS virus）是单股正链RNA病毒，是猪繁殖与呼吸综合征的病原，该病是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。PRRSV感染各种品种和年龄的猪，妊娠母猪和1月龄内仔猪最易感[3]。主要是接触传播、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。从病猪的鼻腔、粪便及尿中均可检测到病毒。链球菌病(Streptococcus suis)是由链球菌属中致病性链球菌所致的一种传染病，多发于3～12周龄的猪，尤其是断奶仔猪易感染此病，给养猪业造成巨大的经济损失。

2016年11月2日，黑龙江省某猪场暴发传染病，流行病学调查了解该猪场养仔猪20头，母猪30头，发病率10%，死亡率4%，猪群出现渐进性消瘦，食欲不振、咳嗽、呼吸困难、体温升高，怀孕母猪流产等现象。送检猪表现为两耳尖发绀，背部皮肤深紫色，被毛凌乱，眼睛流泪有污垢，四肢坏死，剖检表现为髂下淋巴结、腹股淋巴结严重肿大，胃底出血，脾肿大，并且肺间质明显伴有出血点，气管中有泡沫状物，胸腔积液以及肋壁黏连等现象。

1 材料与方法

1.1 采集病料

无菌采集病死猪的肝脏、脾脏、肾脏和淋巴结等病料用于诊断。

1.2 引物设计

根据GenBank中已发表的猪瘟病毒、圆环病毒、巴氏杆菌、伪狂犬病毒和蓝耳病病毒的基因序列设计特异引物，送哈尔滨博仕生物有限公司合成（表1）。

1.3 细菌分离

无菌条件采集肝脏病料，接种血脂培养基于37 ℃恒温培养24 h，观察菌落形态和溶血等情况。挑取疑似单菌落进行纯培于37 ℃恒温培养24 h，观察菌落形态。

1.4 生化试验

细菌纯培养后，分别接种于山梨醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、乳糖、明胶、甘露醇和肌醇等系列生化培养基，37 ℃培养24 h观察生化反应特性。

1.5 药敏试验

将鉴定的菌培养物用接种于血平板，将药敏纸片（庆大霉素、卡那霉素、恩诺沙星等10种药物）分别贴于平皿上37 ℃培养24 h，测定抑制菌圈直径大小，根据检测标准判定结果。

1.6 核酸的提取及鉴定

按照TIANamp Genomic DNA Kit和RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒分别提取DNA和RNA，做模板用猪瘟病毒、蓝耳病病毒、圆环病毒、多杀性巴氏杆菌、链球菌等特异性引物进行PCR扩增，结果于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果与分析

2.1 革兰氏染色

将分离菌进行纯培养后，观察到血平板上长出圆润、表面光滑、有乳光的细小菌落，对其进行革兰氏染色镜检，见革兰氏染色阳性，染色可见球形、卵圆形成链排列的球菌，疑似链球菌（图1）。

图1 球形、卵圆形链状排列的球菌

表1 引物序列

表2 生化试验

表3 药敏分析

图2 PCR电泳图

2.2 生化鉴定

分离的细菌进行纯培养后，接种于山梨醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、乳糖、明胶、甘露醇和肌醇的生化培养基，37 ℃培养24 h 后观察生化反应特性，鉴定结果表明该菌可分解葡萄糖产酸，符合猪链球菌的生化特性（表2）。

2.4 药敏分析

该病原菌对硫酸头孢喹肟和头孢唑啉高度敏感,对氟苯尼考、阿米卡星和强力霉素敏感，对庆大霉素、恩诺霉素、环丙沙星、林可霉素和阿奇霉素耐药（表3）。

2.5 PCR结果

PCR或RT-PCR检测结果表明，第3孔在320 bp左右有一条清晰的条带，与蓝耳病病毒片段大小相符；第4孔在490 bp左右有一条清晰条带，与圆环病毒片段大小相符（图2）。

3 讨论

通过对该猪场送检的病猪进行实验室检测最终诊断为猪圆环病毒、蓝耳病病毒和链球菌混合感染。调查了解到该猪场接种了猪瘟疫苗，但是检测发现抗体的水平已经不能够抵抗病毒，所以造成疾病的流行，对于该猪场提出以下几点建议用于预防和控制疾病的蔓延。

1)疫苗免疫：对于健康的猪群应及时接种疫苗，提高抵抗力，目前市面的疫苗种类多样，要根据区域流行毒株进行正确选择疫苗[4]，必要时采取全群疫苗免疫的策略，圆环病毒疫苗和蓝耳病疫苗可以适当进行同时免疫[5]，具体情况要根据实际做出调整。

2)控制种源：尽量做到自繁自养，严禁从疫区引进种猪，猪群准运后要彻底进行消毒，保证猪群环境的合理通风，控制湿度和温度，减少温差的影响。养猪采用全进全出的模式等，空置2周以上再引进新猪群，新猪群在补栏前应隔离观察，进行灭活疫苗的基础免疫等[6]。

3)加强生物安全措施：规模化养殖场要进行封闭管理，减少人员的流动性，做好消毒工作，一旦发现可疑病例立即上报，做到正确的处置[7]。良好的免疫是预防的关键，防止猪圆环病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒等病毒性疾病与巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌等细菌性疾病的混合感染[8]。保证血清学和抗体水平的实时监测，免疫程序要根据猪群抗体水平进行适当的调整。

4）进行安全生产人员的知识普及，提高其疾病的防治水平和相关的政策理解能力，定期进行防疫管理方式的改变，在有关专家指导下执行准确用药方案，预防细菌性等感染，提高整体猪群的健康水平[9]，只有这样才能使疾病的防控工作做得更加科学、合理以及安全。

[1] 丁淑燕,朱瑞良,高玲美.猪圆环病毒的研究进展[J].中国畜牧兽医,2004,31（3）：41-43.

[2] 樊福好.PMWS 的诊断与防制措施[J].河北畜牧兽医,2003（4）：35-36.

[3] 田克恭.高致病性猪蓝耳病流行现状与免疫防控进展 [J].中国猪业 ,2010(6)﹕9-11.

[4] 康丽娟，张凤玲，于德和，等.猪圆环病毒病Ⅱ型的诊断与防治[J]. 现代畜牧兽医，2005（10）：27-28.

[5] 宋长绪，梁鹏帅. 猪圆环病毒病(PCVD)研究进展[J]. 广东农业科学，2010 ，37(9)：34-37.

[6] 薛健. 猪圆环病毒的研究进展[J].国外畜牧学—猪与禽，2015,35(1)﹕50-52．

[7] 钟文彬. 蓝耳病与圆环病毒病的相互作用机制 [J].今日养猪业，2015,(1)﹕42-43.

[8] 张文奎.猪肺疫的诊断与防制[J]. 山东畜牧兽医，2013 (3)：21-22.

[9] 夏伟,蔡高忠,张宇辉，等.高致病性蓝耳病、猪圆环病毒病继发副猪嗜血杆菌感染的诊断和综合控制措施[J]. 畜牧兽医科技信息,2011(4)﹕5-8．

2016-12-07）

马莉莉 (1992-) 女，黑龙江人，在读硕士，研究方向为分子细菌学和免疫学

*通讯作者：倪宏波(1972-)男，黑龙江人，教授，博士生导师，主要从事分子细菌学和免疫学研究