芪参益气滴丸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制研究

陈君，李蕾，陈国华，刘传亮，李文通

（1.潍坊医学院 研究生院，山东 潍坊 261042；2.山东省潍坊市人民医院 保健三科，

山东 潍坊 261041；3.山东省潍坊市人民医院 健康管理中心，山东 潍坊 261041）

芪参益气滴丸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制研究

陈君1，李蕾2，陈国华3，刘传亮2，李文通1

（1.潍坊医学院 研究生院，山东 潍坊 261042；2.山东省潍坊市人民医院 保健三科，

山东 潍坊 261041；3.山东省潍坊市人民医院 健康管理中心，山东 潍坊 261041）

目的 探讨芪参益气滴丸（QS）对大鼠心肌缺血再灌注时，心肌细胞尿路上皮癌胚抗原1（UCA1）长链非编码RNA、凋亡及凋亡相关基因表达的影响。方法结扎SD大鼠冠状动脉左前降支，造成心肌缺血40 min后剪断结扎线，再灌注120 min，复制实验性心肌缺血再灌注模型，将36只大鼠随机分为假手术组（只穿刺不结扎，Control组）、缺血再灌注组（I/R组）、QS干预组（QS+I/R组），术后采用原位末端标记法检测心肌细胞凋亡指数，采用荧光定量聚合酶链反应分析并检测3组大鼠心脏组织中UCA1的表达，Western blot检测p27蛋白表达水平。结果QS+I/R组的细胞凋亡数与I/R组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与I/R组比较，QS+I/R组UCA1整体表达水平上升，而p27蛋白减少（P＜0.05）；并且UCA1与p27蛋白的表达呈负相关。结论QS能降低大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡率，其可能通过上调UCA1水平，减少p27蛋白表达，保护损伤的心肌细胞。

芪参益气滴丸；心肌缺血再灌注；细胞凋亡；尿路上皮癌胚抗原1；p27蛋白

缺血性心脏病是冠状动脉疾病死亡的最常见原因。对缺血心肌的血流再恢复虽然能降低整体死亡率，但是增加了再灌注损伤，即心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI），这极易导致心力衰竭、心律失常，甚至猝死，严重影响患者心功能。目前，中药制剂防治MIRI研究已取得长足进展[1-2]。大量研究表明，芪参益气滴丸（qishenyiqi dripping pills，QS）对 MIRI具有一定保护作用[3]，但其作用机制却少有研究。本实验以SD大鼠复制MIRI模型，进一步探索研究芪参益气滴丸对MIRI的保护作用。

1 材料与方法

1.1 复制心肌缺血再灌注模型

健康雄性SD大鼠36只，体重210～240g，由潍坊医学院基础实验室提供。36只大鼠随机分成3组，即假手术组（Control组）、缺血再灌注组（I/R组）及芪参益气滴丸（天津天士力股份有限公司）干预组（QS+I/R组）。常规复制大鼠缺血再灌注模型[4]。Control组只穿线不结扎，用生理盐水灌胃，3次/d，持续4周；I/R组：缺血40 min后再灌注120 min，复制心肌缺血再灌注模型前给予生理盐水灌胃，3次/d灌服，连续4周；QS+I/R组：复制模型同I/R组，复制模型前给予芪参益气滴丸1.5 g/（kg·次）灌胃，溶于2 ml生理盐水中，3次/d灌胃，连续灌服4周。

1.2 观察指标

1.2.1 心肌细胞凋亡测定 大鼠再灌注后2%戊巴比妥钠麻醉（40 mg/kg，腹腔注射），采取静脉血2.5 ml，快速取出心脏，摘除血管、脂肪等多余组织，10%甲醛固定，30%蔗糖脱水，取心肌组织约5 mm厚，石蜡包埋，制成5 μm切片。每只大鼠随机取5张切片，根据末端脱氧核苷酸转移酶介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法，严格照说明书步骤对进行操作。切片放置光镜下观察，高倍镜下正常心肌细胞核呈深蓝色，显示棕色核者为凋亡细胞（见图1）[5]。细胞凋亡测定设备购自德国宝灵曼公司。每张切片中各选取5个高倍镜下视野，观察并计算心肌细胞凋亡率（心肌细胞凋亡率=镜下心肌细胞凋亡数/镜下心肌细胞总数×100%）。

1.2.2 心肌组织中尿路上皮癌胚抗原1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）的表达 提取新鲜心肌组织中总RNA，逆转为cDNA后，采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析并检测 3 组大鼠心脏组织中UCA1的表达，具体操作步骤参考文献[6]。

1.2.3 Western blot检测p27蛋白的表达 各组大鼠处死后取出心脏，取结扎线以下的左心室心肌组织，加入蛋白裂解液中研磨，取其变性后的上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白转至聚偏氟乙烯膜，10%脱脂奶粉、三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗涤，加入 p27一抗，4℃过夜，加入相应二抗孵育30 min，用增强化学发光法试剂显影，凝聚成像系统进行扫描处理。Quality one软件对显色后结果进行灰度分析，并计算出p27蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，方差齐则两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芪参益气滴丸对大鼠心肌细胞凋亡的影响

在荧光显微镜下，I/R组、QS+I/R组及Control组细胞凋亡率比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。QS+I/R组大鼠的细胞凋亡率低于I/R组，但两组均高于Control组。见附表和图1、2。

附表 3组大鼠心肌细胞凋亡率、UCA1及p27蛋白表达的比较 （n=12，±s）

附表 3组大鼠心肌细胞凋亡率、UCA1及p27蛋白表达的比较 （n=12，±s）

组别p27蛋白Control组 2.34±0.25 1.03±0.13 0.58±0.08 I/R 组 10.03±0.97 0.39±0.04 1.23±0.12 QS+I/R 组 4.18±0.59 0.72±0.11 0.75±0.10 F值 8.330 26.590 10.350P值 0.002 0.007 0.015细胞凋亡率/%UCA1

2.2 芪参益气滴丸对大鼠心肌细胞UCA1表达水平的影响

I/R组、QS+I/R组及Control组长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）UCA1表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。QS+I/R组和I/R组大鼠UCA1表达较Control组下降，但QS+I/R组大鼠UCA1表达下降程度低于I/R组。见附表和图3。

图1 3组大鼠心肌细胞凋亡情况 （荧光显微镜×200）

图2 3组大鼠心肌细胞凋亡率比较 （n=12，±s）

图3 3组大鼠心肌细胞UCA1相对表达量 （n=12，±s）

图4 3组大鼠心肌细胞p27蛋白相对表达量（n=12，±s）

2.3 芪参益气滴丸对大鼠心肌细胞p27蛋白表达的影响

I/R组、QS+I/R组及Control组p27蛋白表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。QS+I/R组和I/R组大鼠p27蛋白表达较Control组升高，但QS+I/R组大鼠p27蛋白表达水平低于I/R组。见附表和图4、5。

图5 p27蛋白的表达

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是临床上冠状动脉内溶栓、冠状动脉搭桥及心血管介入治疗中常见的严重并发症，其发生机制复杂[7]。研究发现，细胞凋亡参与MIRI过程，并在缺血再灌注诱导的病理过程中发挥重要作用[8]。抑制心肌细胞凋亡可显著缩减I/R后心肌梗死体积，减轻心肌损伤，改善心功能[9-10]。因此，减少或抑制MIRI中心肌细胞凋亡，对临床治疗和预防MIRI，改善心肌梗死患者预后具有重要意义。最新研究发现，LncRNA UCA1可通过下调肿瘤抑制基因p27，对心肌细胞凋亡产生影响[11]。这对研究MIRI中有关参与调节细胞凋亡程序的分子成分提供新的视角。

LncRNA UCA1是最近几年发现的一种长链非编码RNA，其最早在人膀胱移行细胞癌中发现，并在膀胱癌患者的尿液中检出[12]。在正常成人中，UCA1基因仅在心脏、脾脏表达，并且心脏表达水平较高，表明其可能是潜在的心血管疾病的标志物[13-14]。有研究表明，在膀胱恶性肿瘤细胞中，膀胱癌细胞中UCA1下调能够降低膀胱癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，提示心肌组织中UCA1表达下调可能起抑制心肌细胞增殖，促进心肌细胞凋亡的作用，表明UCA1可能在心脏保护方面发挥重要作用[15]。

p27蛋白作为一种肿瘤抑癌基因，可参与多种基因和蛋白的调控，主要是通过抑制细胞周期或者其他不确定机制来实现[16]，TAMAMORI-ADACHI等[17]报道，p27蛋白表达的下调能够促进大鼠新生心肌细胞的增殖。本研究结果表明，I/R组大鼠不仅细胞凋亡数增加，而且心肌细胞p27蛋白表达也上升，提示p27上调与细胞凋亡紧密相关。有研究证实，p27蛋白的过度表达抑制心肌活性，促进细胞凋亡[18]。

本实验中笔者发现，UCA1水平在大鼠缺血性心肌再灌注后降低，而p27蛋白的表达却增加，p27蛋白的过度表达抑制心肌活性，促进细胞凋亡。研究表明，p27引发细胞凋亡机制与Caspase-3的激活有一定关联[19]。心肌细胞凋亡潜在的确切分子机制可能包括依赖于UCA1下调的p27过度表达[11]。

参益气滴丸是纯中药制剂，是中医理论基础上取自黄芪、丹参、降香及三七4味中药精制而成的益气活血处方。方中重用黄芪为君，取其补气血、促血行和培元固本之效；丹参活血调血，兼养心血，安神定志，用之为臣；三七活血散瘀，助丹参祛瘀止痛，为佐药；最后辅以降香行气解郁，温通行滞。诸药合用，发挥良好协同作用，起到通络止痛、益气活血之效。现代药理学研究表明，黄芪能够增强心肌收缩，扩张冠状动脉，并能够使患者的血浆内皮素、肿瘤坏死因子、心钠素、血管紧张素下降，有效修复心肌供血，调理患者血压，对缺血心肌有保护作用[20]。丹参具有抗氧化、清除自由基和抑制细胞内钙超载、维持心肌能量代谢、减少血小板聚集、降低血液黏度、降低细胞凋亡因子的表达等作用，有效缓解冠状动脉痉挛，改善心肌血供和代谢，临床广泛应用于心血管疾病的治疗[21]。三七中的三七总皂成分具有扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量的作用，还能够降低血压，改善心肌供血，提高心功能；降香能够降低炎症反应，抑制细胞坏死，抑制血栓形成，改善局部微循环[22-23]。综上所述，芪参益气滴丸通过多层面、多体系的参与，对心肌缺血再灌注损伤起到一定保护作用。

本研究重点观察芪参益气滴丸对缺血再灌注模型大鼠心肌UCA1和p27蛋白表达的影响，结果显示，芪参益气滴丸治疗组的细胞凋亡数少于I/R组。与I/R组比较，QS+I/R组UCA1表达水平上升，同时p27蛋白降低。并且发现UCA1与p27蛋白的表达呈负相关，提示芪参益气滴丸可能通过上调UCA1水平，减少p27蛋白表达，减少心肌细胞凋亡。已有研究证实，UCA1可通过下调肿瘤抑制基因p27，对心肌细胞凋亡产生影响[11]。

综上所述，芪参益气滴丸可减少心肌细胞凋亡，对缺血再灌注心肌损伤有一定保护作用，其作用机制可能与上调UCA1水平、减少p27蛋白表达相关。

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（童颖丹 编辑）

Protective effect of Qishenyiqi Dripping Pills on rats with myocardial ischemia-reperfusion injury

Jun Chen1,Lei Li2,Guo-hua Chen3,Chuan-liang Liu2,Wen-tong Li1
(1.Graduate School,Weifang Medical University,Weifang,Shandong 261042,China;2.The Third Department of Health,3.Health Management Center,Weifang People's Hospital of Shandong,Weifang,Shandong 261041,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Qishenyiqi Dripping Pills on urothelial carcinoma antigen 1 (UCA1)LncRNA,apoptosis and apoptosis related gene expression of myocardial cells in rats with myocardial ischemia reperfusion.MethodsIschemia reperfusion injury model of SD rats was established by ligating left anterior descending branch of coronary artery for 40 min followed by reperfusion for 120 min.Thirty-six rats were randomly divided into sham operation group(only puncture wihout ligation),ischemia-reperfusion group(IR group)and Qishenyiqi intervention group (QS+IR group).After operation,the apoptosis index was detected by TUNEL method;fluorescence quantitative PCR technique and Western blot were used to detect the expression levels of UCA1 and p27 protein respectively.ResultsThe number of apoptosis in the QS+IR group was significantly smaller than that in the IR group(P＜0.05).The overall level of UCA1 expression significantly increased and p27 protein markedly decreased in the QS+IR group compared with the IR group(P＜0.05);and the expression of UCA1 was negatively correlated with the expression of p27 protein.ConclusionsQishenyiqi Dripping Pills can reduce myocardial apoptosis rate in rats with myocardial ischemia and reperfusion,which may protect the injured myocardial cells by increasing the level of UCA1 and reducing the expression of p27protein.

Qishenyiqi Dropping Pill;myocardial ischemia reperfusion;apoptosis;urothelial carcinoma antigen 1;p27 protein

R285

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.006

1005-8982（2017）12-0030-05

2016-11-23

陈国华，E-mail：13022783557@163.com