Cat B和Cys C在食管癌组织中的表达

闫 焱，周 昆，易巧丽，樊青霞

(1.郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052；2.郑州大学第一附属医院胸外科，河南 郑州 450052)

Cat B和Cys C在食管癌组织中的表达

闫 焱1，周 昆2，易巧丽1，樊青霞1

(1.郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052；2.郑州大学第一附属医院胸外科，河南 郑州 450052)

目的 探讨组织蛋白酶B(Cat B)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)在食管癌组织中的表达及临床意义。方法 采用免疫组化及荧光定量PCR对56例食管癌及相对应的癌旁正常食管黏膜组织中Cat B和Cys C表达进行检测。结果 与癌旁正常食管黏膜组织比较，食管癌组织中Cat B和Cys C的mRNA和蛋白表达均明显上调(P<0.05)。Cat B和Cys C的表达显著正相关(rs=0.970，P<0.05)。Cat B 和Cys C的表达均与淋巴结转移有关，Cys C的表达还与肿瘤侵袭程度有关(P<0.05)。结论 Cat B和Cys C在食管癌组织中均呈高表达，且其高表达与肿瘤恶性程度相关，有望成为食管癌早期诊断及预后判断的分子标志物。

组织蛋白酶B；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；食管癌

食管癌是世界范围内排名前10位的最常见恶性肿瘤之一，也是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。中国是食管癌的高发地区，其死亡率仅次于胃癌。恶性肿瘤侵袭和转移常常是造成患者死亡的主要原因。组织蛋白酶B(Cathepsin B,Cat B)是一种溶酶体内的半胱氨酸蛋白水解酶，其通过参与细胞外基质蛋白的降解,促进肿瘤细胞侵袭转移过程和肿瘤血管生成等途径在恶性肿瘤的发展中扮演着重要角色[1-3]。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C,Cys C)作为组织蛋白酶抑制剂与组织蛋白酶互相作用在肿瘤的发生、发展中起到十分重要的作用[4-6]。本试验研究Cat B和Cys C在人食管癌组织中的表达，以评估Cat B和Cys C作为食管癌早期诊断分子标志物的可行性。

1 材料与方法

1.1 组织样本 选取2009年3月至2011年5月郑州大学第一附属医院收治的经病理学确诊的56例食管癌患者及其配对癌旁正常食管黏膜组织的手术切除标本。正常食管黏膜组织取自切除食管断端，距肿瘤切缘约5 cm，均经病理学确认为正常食管黏膜组织。所有患者术前均未接受化疗、放疗或中药等其他针对肿瘤的治疗，新鲜组织采用手术分离并在术后立即置于液氮中，部分组织常规石蜡包埋。56例患者基线资料：男31例，女25例；年龄36～77岁，中位年龄为59.5岁；鳞癌39例，腺癌16例；高分化11例，中分化25例，低分化组20例；浸润深度：T1(肿瘤只侵及黏膜下层或黏膜固有层)6例，T2(肿瘤侵及肌层)18例，T3(肿瘤侵及纤维膜)18例，T4(肿瘤侵及临近结构)14例；无淋巴结转移20例，有淋巴结转移36例。

1.2 免疫组化检测中Cat B和Cys C表达 将标本石蜡切片脱蜡，浸入0.01 mol·L-1构椽酸盐缓冲液中，加热95 ℃保持15 min，滴加体积分数3%过氧化氢，室温下避光孵育。滴加Cat B和Cys C一抗(武汉三鹰生物技术有限公司，1100)，入湿盒内4 ℃过夜。次日滴加生物素标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育，DAB显色，苏木素复染，质量分数1%盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。用PBS代替一抗作阴性对照，选用癌旁正常食管黏膜做切片内阴性对照，阳性对照片由抗体公司提供。分别由2位经验丰富的病理科医生在不知标本临床和病理资料的情况下独立观察切片，对免疫组化结果进行评分。意见一致者予以采纳，意见不一致者重新商定。Cat B和Cys C阳性细胞均以细胞呈黄色、棕黄色、棕褐色颗粒为准，着色高于背景，或背景不着色而细胞质着色为阳性。采用Mattern的半定量积分法：根据着色深浅程度及着色阳性上皮细胞所占百分比(%)，对表达强度进行半定量评估分级，分为-、±、+、++，其中-为阴性，±、+、++为阳性。

1.3 荧光定量PCR检测Cat B和Cys C mRNA表达 Trizol试剂提取组织中RNA，用反转录试剂盒进行反转录为cDNA，根据Cat B和Cys C的cDNA序列设计荧光定量PCR引物，Cat B-QF，GCTACAGCCCGACCTACAAACAG，Cat B-QR，GAGCAGGAAGTCCGAATACACAGA，Cys C-QF CCGTCGGCGAGTACAACAAAG，Cys C-QR CCA-GCTCCACGTCCAAGAAGTAGT，GADPH-QF，AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，GADPH-QR，AGGGGCCATCCACAGT-CTTC。然后进行荧光定量PCR扩增反应，结果采用2-ΔΔCt进行计算。

2 结果

2.1 免疫组化检测组织样本中Cat B和Cys C蛋白的表达 Cat B和Cys C在食管癌及癌旁正常食管黏膜组织中均有不同程度的表达。Cat B主要着色于细胞质与邻近细胞膜，食管癌和癌旁正常食管黏膜组织中蛋白阳性率分别为60.7%(34/56)及19.6%(11/56)(χ2=19.651，P<0.001)。食管癌组织中Cys C主要着色于细胞质中，呈淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒，少数细胞膜亦有表达，一些癌旁正常上皮组织中亦有较弱表达，食管癌和癌旁正常食管黏膜组织中Cys C蛋白阳性率分别为94.6%(53/56)及12.5%(7/56)(χ2=75.959，P<0.001)。食管癌组织中Cat B和Cys C的表达显著正相关(rs=0.970，P<0.05)。见图1。

2.2 食管癌组织中Cat B和Cys C的蛋白表达强度与临床病理特征的关系 Cat B 和Cys C的表达均与淋巴结转移有关，Cys C的表达还与肿瘤侵袭程度有关(P<0.05)。见表1。

2.3 荧光定量PCR检测组织样本中Cat B和Cys C mRNA表达 以每例样本自身癌旁正常食管黏膜组织为对照，食管癌组织中Cat B和Cys C mRNA的相对表达量均明显升高(t=3.225，P<0.001)。见图2。

3 讨论

恶性肿瘤的特征性表现是浸润和转移，肿瘤细胞产生的半胱氨酸蛋白酶等多种水解酶能降解细胞外基质，破坏黏膜屏障，促使肿瘤细胞穿透基底膜向深层组织浸润及远处转移[7]。存在于细胞质溶酶体中的Cat B属于半胱氨酸蛋白酶的一种，可降解多种细胞外基质，如多型胶原、纤连蛋白等，参与肿瘤的浸润和转移。Cat B在前列腺癌、头颈部癌、肺癌、结直肠癌等多种肿瘤组织中表达增高[8-11]。Cys C是Cat B最主要的抑制剂，可以与半胱氨酸蛋白酶结合形成酶-抑制剂复合物，从而阻止Cat B对间质组织及基底膜的破坏作用，抑制肿瘤细胞的侵袭能力[12-13]。Cys C在多种恶性肿瘤组织及细胞中表达上调，例如卵巢癌、非小细胞肺癌等[14-15]。然而，Yano等[7]在乳腺癌组织中得到了相反的结论。同样，Kothapalli等[16]发现在大颗粒淋巴细胞白血病中Cys C基因表达下调。

图1 Cat B(A:食管癌；B：癌旁)和Cys C(C:食管癌；D：癌旁)在不同食管组织中的表达(S-P，×400)

组别nCatB-±+++CysC-±+++肿瘤分化程度 高分化1153212432 中分化251247216126 低分化20538403107肿瘤侵袭程度 T1+T224123721896 T3+T43210710525169淋巴结转移 无2074632765 有36156114161910

注：Cat B：肿瘤分化程度χ2=3.927,P=0.140；肿瘤侵袭程度Z=1.022,P=0.307；淋巴结转移Z=4.191,P<0.001。Cys C：肿瘤分化程度χ2=4.636,P=0.098; 肿瘤侵袭程度Z=3.118,P=0.002；淋巴结转移Z=4.930,P<0.001

本研究发现食管癌组织中Cat B和Cys C蛋白及mRNA水平均较癌旁正常食管黏膜组织升高，并且食管癌组织中两者的表达显著正相关。Cys C表达水平的升高，可能是由于机体反馈调节机制的结果，食管癌组织中Cat B表达增加，会反馈性引起Cys C表达的增多，而增加的Cys C抑制了Cat B的活性，以降低肿瘤细胞的浸润侵袭能力。我们的研究还发现，Cat B和Cys C的表达均与食管癌淋巴结转移有关，Cys C的表达还与肿瘤侵袭程度有关，这提示Cat B和Cys C与食管癌发生、发展机制密切相关。

总之，Cat B 和Cys C在食管癌组织中均显著高表达，可以作为食管癌早期诊断的分子标志物之一。探索Cat B和Cys C对食管癌发生、发展的具体作用及机制，可以为食管癌分子靶向治疗提供新的思路及方向。

图2 Cat B(左)和Cys C(右)mRNA在不同食管组织中的表达

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Expressions of Cat B and Cys C in the Esophageal Carcinoma

YAN Yan1,ZHOU Kun2,YI Qiaoli1,FAN Qingxia1

(1.DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China; 2.DepartmentofThoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To investigate the expressions of Cathepsin B(Cat B) and Cystatin C(Cys C) gene in the esophageal carcinoma.Methods Fifty-six patients with esophageal carcinoma were randomly collected,and the Cat B and Cys C expressions of esophageal carcinoma and matched normal esophageal mucosal samples were were determined by immunohistochemistry and qRT-PCR.Results Compared with normal esophageal mucosal tissues,mRNA and protein levels of Cat B and Cys C in the esophageal carcinoma tissues were significantly increased (P<0.05).Cat B was positively related with Cys C in the esophageal carcinoma tissues(rs=0.970，P<0.05).The expressions of Cat B and Cys C were related with lymph node metastases and the expression of Cys C was related with degree of tumor invasion(P<0.05).Conclusion These results show that mRNA and protein levels of Cys C in esophageal carcinoma tissues were significantly increased.They are expected to be a molecular marker for the early diagnosis of esophageal carcinoma.Cat B and Cys C expression were high in the esophageal carcinoma,and their high expressions are related to tumor malignant degree,and Cat B and Cys C can be used as the early diagnostic and prognostic molecular markers of esophageal carcinoma.

Cat B; Cys C; esophageal carcinoma

国家自然科学基金资助项目(编号：81672424)；河南省科技攻关项目(编号：201702010)

闫焱(1982-)，女，博士，主要从事食管癌的基础与临床研究。E-mail：happyyy0721@163.com

樊青霞(1952-)，女，教授，主任医师，博士生导师，主要从事肿瘤基础与临床研究。E-mail: baihe3@tom.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.03.001

R735.1；R730.23

A

1673-5412(2017)03-0185-04

2016-12-23)