龙血竭总黄酮对新西兰兔心肌缺血/再灌注损伤作用的研究

程初勇　潘小妮　刘文静　黄照河

[摘要]目的研究龙血竭总黄酮对新西兰兔心肌缺血/再灌注损伤的保护作用。方法将30只新西兰兔随机分为三组，每组10只。采用结扎新西兰兔左冠状动脉前降支法，建立心肌缺血/再灌注损伤模型。观察心肌组织HE染色的结构变化，测量左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax），检测心肌肌酸激酶同工酶（CK-MB）。结果龙血竭处理组心肌组织结构明显好于缺血/再灌注组；缺血/再灌注组和龙血竭处理组+dp/dtmax均明显低于假手术组（P<0.01），龙血竭处理组+dp/dtmax高于缺血/再灌注组（P<0.01）；缺血/再灌注组CK-MB水平明显高于假手术组（P<0.01），龙血竭处理组CK-MB水平高于假手术组（P<0.05），并低于缺血/再灌注组（P<0.01）。结论龙血竭总黄酮能够改善心肌缺血/再灌注损伤，保护心肌组织结构，稳定细胞膜结构，减少心肌CK-MB漏出，提高缺血/再灌注损伤模型心肌的收缩功能。

[关键词]缺血/再灌注损伤；龙血竭总黄酮；左心室内压最大上升速率；肌酸激酶同工酶

中图分类号：R542.2 文献标识码：A 文章编号：1009-816X（2017）03-0203-03

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2017.03.15

据研究我国急性心肌梗死发生率2008年与2002年比较呈上升趋势，冠心病死亡粗率城市地区上升2.40倍，农村地区上升2.84倍，2008年冠心病死亡粗率城市居民为91.41/10万，农村居民为51.89/10万。急性心肌梗死病死率升高的诸多因素中心功能不全是第一位危险因素。即使冠状动脉血运重建技术日益完善，而血管再通后的死亡总人数逐年升高，有必要找到新的治疗方法，降低血管再通后的死亡率。中药是我国长期治病防病实践过程中积累的宝贵财富，具有极大的应用价值。龙血竭是广西传统名贵壮药，从百合科植物剑叶龙血树的含脂木材提取得到的树脂，其性温、平，味甘，无毒。具有抗菌、抗痉挛、消炎及镇痛等效果，还存在有抗糖尿病及抗肿瘤的活性，同时也具有增强免疫功能，促进皮肤修复、止血及增强血液循环等功效。此次实验是通过新西兰兔心肌缺血/再灌注模型，研究龙血竭总黄酮对新西兰兔心肌缺血/再灌注损伤的保护作用，为治疗心肌缺血/再灌注损伤找到新的治疗措施，降低心肌梗死的死亡率。

1材料和方法

1.1动物：新西兰兔，体重为2.0～3.0kg，雌雄不限。右江民族医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK桂2012-0003。

1.2分组、造模：将30只新西兰兔随机分成三组：假手术组、缺血/再灌注组、龙血竭处理组，雌雄不限，每组10只。假手术组与缺血/再灌注组每天0.9%氯化钠注射液5ml灌胃，龙血竭处理组用龙血竭总黄酮180mg/kg·d溶于5ml 0.9%氯化钠注射液灌胃。手术前灌胃给药，连续给予10天。手术前禁食12小时，按照1.0g/kg应用20%氨基甲酸乙酯耳缘静脉注射麻醉新西兰兔，仰卧位固定手术台上，四肢皮下连接ECG-6511型心电图机（上海光电医用电子仪器有限公司），监测动物心电图，剪去颈部毛发，切开皮肤，暴露气管，行气管插管，连接V-100型小型动物呼吸机（上海玉研科学仪器有限公司X呼吸频率：45～50次/分钟，潮气量16～20ml，呼吸比1：1）。参照Cheng文献方法造模。造模过程中，Ⅱ导联ST段弓背抬高，心肌组织变为暗红色为造模成功。龙血竭总黄酮由桂林三金药业药品研究所提供，红褐色粉末状，应用0.9%氯化钠注射液作为溶剂。20%氨基甲酸乙酯（成都市科龙化工试剂厂），肌酸激酶同工酶（CK-MB）测定试剂盒（德赛诊断系统上海有限公司）。

1.3检测指标：测量新西兰兔左心室内压最大上升速率（+dP/dtmax），采取血液和心肌组织标本所有实验动物均在心肌再灌注2小时时，用15G注射针头连接医用动脉测压管，动脉测压管再连接到BL-420E+生物机能实验系统（成都泰盟科技公司），将注射针头直接从心尖部插入左心室，测量左室内压，得到+do/dtmax。直接从右心房取5ml血液，离心得到血清，保存-20℃冰箱备用。将心脏分离出体外，选用颜色较深的左心室前壁心肌组织10%中性福尔马林固定，以备HE常规染色。实验全部结束后，利用日立7600全自动生化分析仪检测血清CK-MB。

1.4统計学处理：应用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，再两两比较用LSD方法，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1缺血/再灌注对新西兰兔心肌组织的影响：假手术组：心肌组织HE染色浓淡均匀一致，细胞核清晰可见，心肌纤维结构清楚，排列整齐有序（图1A）；缺血/再灌注组：心肌组织HE染色程度浓淡不一，细胞核清晰度欠佳，心肌纤维排列紊乱，可见纤维断裂现象，组织间红细胞渗出（图1B）；龙血竭处理组：心肌组织HE染色胞浆轻微浓染，心肌纤维较为清晰，结构比较规则，细胞核染色均匀，组织间可见少量红细胞渗出（图1C）。

2.2龙血竭总黄酮对+dp/dtmax、心肌CK-MB水平的影响：与假手术组比较，缺血/再灌注组+dp/dtmax明显降低，具有统计学意义（P<0.01）；龙血竭处理组+dp/&max比假手术组明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）；龙血竭处理组与缺血/再灌注组比较，龙血竭处理组+dp/dtmax明显好于缺血/再灌注组（P<0.01）。假手术组检测出心肌酶CK-MB，缺血/再灌注组与假手术组比较心肌酶CK-MB水平明显升高，具有统计学意义（P<0.01）；龙血竭处理组比假手术组心肌酶CK-MB水平明显升高，具有统计学意义（P<0.05）；龙血竭处理组与缺血/再灌注组比较，心肌酶CK-MB水平明显比缺血/再灌注组降低，并具有统计学意义（P<0.01）。

3讨论

心肌缺血/再灌注损伤作用机制复杂，涉及到很多生理病理过程：氧化应激、能量代谢障碍、心肌细胞凋亡、钙超载、自噬、细胞浸润及血管内皮功能障碍等。在Li等的研究中证实心肌缺血/再灌注后，心肌Toll样受体4（toll-like receptors 4，TLR4）和细胞核因子кB（nuclear factorкB，NF-кB）的表达均显著增加，降低B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma2，Bcl-2）蛋白表达水平，并增加Bcl-2相关蛋白x（Bc1-2-associatedx，Bax）表达，诱导心肌细胞凋亡；而Yi掣的研究中证实，龙血竭增加Bcl-2表达，降低Bax蛋白表达，从而保护心肌细胞，这种保护作用是通过抑制细胞外信号调节激酶/NF-кB/聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1/Bax[extracellular signalregulated kinase/NF-kB/poly（ADP-ri-bose）polymerase-1/Bax，ERK/NF-kB/PARP-1/Bax]信号传导级联，随后抑制血管细胞黏附分子-1（vascularcell adhesion molecule 1，VCAM-1）的活化而实现的。龙血竭保护心肌的作用机制可能涉及多个方面，本实验从心肌组织HE染色可以看出，缺血/再灌注组心肌组织结构损伤明顯，而应用龙血竭总黄酮干预后，心肌组织结构明显好于缺血/再灌注组，由此证实在组织解剖层面上龙血竭总黄酮可以保护缺血/再灌注后的心肌组织。

糖尿病会损伤全身血管，并发心脑血管疾病，是冠心病的一个高危因素。糖尿病血管损害的病理机理与心肌缺血/再灌注损伤的病理机理有着许多共同的发病机制：氧化应激、能量代谢障碍、细胞凋亡、细胞浸润及血管内皮功能障碍等。其中糖尿病侵害皮肤血管，并发皮肤溃疡，而龙血竭能够促进糖尿病大鼠溃疡创面愈合优于胰岛素对照组；还有研究证实，龙血竭含有的酚类化合物和生物碱类是伤口愈合时间缩短的主要成分。龙血竭总黄酮对大鼠、犬急性心肌缺血有较好的保护作用，对乳鼠心肌缺血/再灌注损伤也有显著的保护作用。龙血通络胶囊含有龙血竭成分，龙血通络胶囊可以改善高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠的红细胞可变形性、红细胞渗透脆性，降低红细胞膜的脂质过氧化，从而改善高胆固醇血症的微循环。既然龙血竭能够治疗糖尿病皮肤并发症，对犬、大鼠、乳鼠的心肌缺血有着较好的保护作用，预示着龙血竭同样可以治疗心肌缺血/再灌注损伤时遭受损害的心肌收缩功能。+dp/dtmax是反映左心收缩功能比较稳定的一个指标，较少受到心脏前后负荷的影响。前述研究证实龙血竭可以抑制缺血/再灌注心肌细胞凋亡，保护心肌组织结构完整，降低血管通透性，减轻组织水肿，本实验龙血竭处理组+dp/dtmax明显好于缺血/再灌注组，证实龙血竭总黄酮在心肌缺血/再灌注时具有保护左心室收缩功能的作用。

心肌CK-MB水平是诊断心肌梗死的酶学指标之一，具有较强的特异性。此次实验，假手术组心肌CK-MB水平也有检出，可能因为骨骼肌创伤所致。实验中，缺血/再灌注组CK-MB水平升高最为明显，而龙血竭处理组较假手术组CK-MB水平有显著性升高，但比缺血/再灌注组低，由此得出龙血竭总黄酮可以降低新西兰兔缺血/再灌注模型心肌CK-MB水平。

本研究表明，龙血竭总黄酮能够改善心肌缺血/再灌注损伤，保护心肌组织结构，保持细胞膜稳定，减少心肌酶CK-MB漏出，提高耐受能力，从而保护心肌的收缩功能。本研究为治疗心肌缺血/再灌注损伤提供了一个新的线索，但需进一步深入研究其作用的分子机制。