山核桃仁多酚提取工艺及其抗氧化活性研究

俞憬　陈冠林　杨璐齐

摘要：以山核桃（Carya cathayensis）仁为材料，采用单因素试验和正交试验辅助超声波提取其中的多酚，确定多酚提取的最佳工艺，采用FRAP、DPPH和ABTS 3种方法测定了山核桃仁多酚的抗氧化能力并用Folin-Ciocalteu法测定其总酚含量。结果表明，多酚提取的最佳工艺组合为料液比1∶50（g∶mL），乙醇体积分数30%，超声时间20 min，提取温度35 ℃。FRAP、DPPH和ABTS法测得山核桃仁多酚的抗氧化活性分别为108.94、184.71和175.92 μmol Trolox/g。山核桃仁多酚是较好的抗氧化剂。

关键词：山核桃（Carya cathayensis）仁；多酚；抗氧化性

中图分类号：S664.1；TS209 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）11-2109-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.029

Abstract： Using hickory（Carya cathayensis） nut kernelas material，ultrasound as a auxiliary extraction method， the single-factor and orthogonal array design methods were used to determine the optimum technologicalconditions for extraction of phenolic compounds. FRAP， DPPH and ABTS methods were used to determine the antioxidant activities of polyphenols in hickory nut kernels， and Folin-Ciocaheu method was used to determine the total phenolic contents. The results indicated that the optimal technological conditions for extracting polyphenols were as follows：the ratio of material to solvent was 1∶50（g∶mL）， volume fraction of ethanol was 30%， extraction time was 20 min， and extraction temperature was 35 ℃. The antioxidant activities of polyphenols in hickory nut kernel measured with FRAP， DPPH and ABTS method were 108.94， 184.71 and 175.92 μmol Trolox/g， respectively. And polyphenols in hickory nut kernel were good antioxidants.

Key words： hickory（Carya cathayensis） nut kernel； polyphenol； antioxidant activity

山核桃（Carya cathayensis）為胡桃科（Juglandaceae）山核桃属（Carya Mutt）植物，是重要的栽培树种之一[1]。山核桃属约有18个种，3个亚种，主要分布在亚洲的东南部以及北美的东部，中国浙江、云南、贵州、湖南、大别山等地分布有5个种[2]。中国核桃资源非常丰富，2010年核桃年产量为128万t，面积和产量均为世界第一[3]。研究发现，核桃仁中蛋白质的含量为9%，含有17种氨基酸，其中7种为人体必需氨基酸。此外，核桃还富含多种不饱和脂肪酸和矿物元素等[4]，具有极高的营养价值以及研究前景。已有学者对核桃仁进行了相关的研究[5-8]，但对山核桃仁多酚提取条件优化的研究较少，对山核桃仁多酚的抗氧化性也缺少系统的研究。因此，本研究对山核桃仁中多酚的提取条件进行优化，采用超高效液相色谱（UPLC）测定其成分，并系统地研究其抗氧化活性，为进一步开发利用该资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：山核桃购于广东省佛山市市场，剥取核桃仁后干燥粉碎。

试剂：乙醇、Trolox（水溶性维生素E）、TPTZ（三吡啶三吖嗪）、FeCl3、HCl溶液、乙酸钠缓冲液、福林-酚试剂、乙醇溶液、DPPH·、过硫酸钾、没食子酸、ABTS+·。

仪器：UV-9600型紫外/可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）、LEO-150S型超声清洗仪。

1.2 方法

1.2.1 山核桃仁多酚提取条件的确定 采用乙醇提取核桃仁中的多酚，中间辅助超声波以提高其含量，并对所得的多酚含量进行测定。通过单因素试验确定各因素的最佳提取条件，在单因素试验的基础上进行4因素3水平正交试验，对影响核桃仁多酚提取效果的各因素进行优化。

1.2.2 DPPH法测定抗氧化活性 取0.1 mL待测样品，加入0.06 mmol/L DPPH·80%乙醇溶液3.9 mL，振荡15 s，放置暗处反应2 h后，于515 nm处测定其吸光度，按公式计算清除率。清除率=（A对照-A样品）/A对照×100%。以3.9 mL DPPH·+0.1 mL 80%乙醇作对照，空白为80%乙醇，以Trolox溶液为标样绘制标准曲线，样品的抗氧化活性用Trolox当量表示，单位为μmol Trolox/g[9]。

1.2.3 FRAP法测定抗氧化活性 FRAP试剂由10 mmol/L的TPTZ（溶于40 mmol/L盐酸）、20 mmol/L的FeCl3、300 mmol/L的乙酸钠缓冲液（pH 3.6）以 1∶1∶10（V/V/V）的比例混合而成。取100 μL待测样品，加入3 mL FRAP试剂中充分混合，反应120 min后于593 nm处测定其吸光度。以Trolox溶液为标样绘制标准曲线，样品的抗氧化活性用μmol Trolox/g表示[10，11]。

1.2.4 ABTS法测定抗氧化活性 将7 mmol/L的ABTS（用pH 4.5、20 mmol/L的乙酸钠配制）和2.45 mmol/L的过硫酸钾等体积混合，室温下避光反应12～16 h，形成ABTS+·储备液。使用前用20 mmol/L乙酸钠（pH 4.5）将ABTS+·储备液稀释为工作液，使其在734 nm处吸光度为0.700±0.002。取100 μL待测样品，加入3 mL ABTS+·工作液，振荡30 s，室温下反应1 h后，在734 nm处测定其吸光度。以20 mmol/L乙酸钠（pH 4.5）为空白，ABTS+·为对照，以Trolox溶液为标样绘制标准曲线，样品的抗氧化活性用TEAC表示[10]，单位为μmol Trolox/g。

1.2.5 总酚含量的测定 取0.50 mL待测样品，加入2.50 mL 1∶10稀释的福林-酚试剂中，反应4 min后，加入2.00 mL 75 g/L的Na2CO3溶液，置室温下反应120 min，于765 nm处测定其吸光度。结果以没食子酸当量表示，单位为mg GAE/g[12，13]。

1.2.6 UPLC色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLCR HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温30 ℃，进样量1 μL，流速0.3 mL/min，流动相为乙腈-甲酸水溶液（0.2%甲酸），梯度洗脱（洗脱程序：0 min，7%乙腈；4 min，16%乙腈；6 min，40%乙腈；7 min，7%乙腈；10 min，7%乙腈）[14]，结果以μg/g DW表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对山核桃仁多酚提取的影响 固定乙醇体积分数为40%，超声时间10 min，提取温度30 ℃，分别以不同料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，g∶mL，下同）提取山核桃仁多酚。由图1可知，料液比为1∶40时山核桃仁多酚的含量最低，料液比为1∶50时山核桃仁多酚的含量最高。因此，确定适宜的料液比为1∶50。

2.1.2 乙醇体积分数对山核桃仁多酚提取的影响 固定料液比为1∶50，提取时间10 min，提取温度30 ℃，分别以不同体积分数（10%、20%、30%、40%、50%）的乙醇提取山核桃仁多酚。由图2可知，乙醇体积分数对山核桃仁多酚提取含量的影响呈波浪形，乙醇体积分数在50%时提取含量最高，再增大乙醇体积分数会增加生产成本。因此，确定适宜的乙醇体积分数为50%。

2.1.3 超声时间 固定料液比为1∶50，50%乙醇，提取温度30 ℃，分别以不同的超声时间（10、15、20、25、30 min）提取山核桃仁多酚。从图3可以看出，超声时间对山核桃仁多酚的提取有明显影响，超声时间为20 min时，山核桃仁多酚含量最高，因此确定20 min为最佳的超声时间。

2.1.4 提取温度 固定料液比为1∶50，提取时间20 min，50%乙醇，分别以不同的提取温度（30、35、40、45、50 ℃）提取山核桃仁多酚。从图4可以看出，35 ℃时核山桃仁多酚含量最高，35 ℃后提取含量呈下降趋势，因此确定35 ℃为最佳的提取温度。

2.2 山核桃多酚提取的正交试验

根据山核桃仁多酚提取的单因素试验结果，确定料液比、乙醇体积分数、超声时间和提取温度为4个主要的影响因素，每个因素选取3个水平（表1），然后设计L9（34）正交试验，试验结果见表2。

由表2可知，影响山核桃中多酚提取效果的因素大小顺序为D>C>A>B，即提取温度>超声时间>料液比>乙醇体积分数，说明提取温度对多酚的提取效果影响最大，其次是超声时间，再次是料液比，而乙醇体积分数对多酚的提取效果影响最小。4个因素的最佳组合方案为A2B1C2D2，即1∶50的料液比，30%的乙醇溶液，超声时间20 min，提取温度35 ℃，在该条件下从1 g山核桃仁中可提取得到21.88 mg GAE/g多酚。

2.3 UPLC分析结果

山核桃仁多酚包括酚酸类和黄酮类两大部分，其色谱见图5。采用UPLC法测定得到每克山核桃仁中多酚物质的含量见表3。由表3可知，在现有的标准中，山核桃仁中槲皮苷的含量最高，达到3 221.31 μg/g（DW）；其次是芦丁，其含量为299.51 μg/g（DW）；香草酸和表儿茶素的含量较低，分别为166.00、130.37 μg/g（DW）。儿茶素具有多种生物活性功能，包括抗菌、抗恶性细胞增生、抗炎、减少内脏脂肪以及降低血清胆固醇和甘油三酯水平[15]。研究發现，芦丁也具有多种生物活性，包括降糖、抗炎、抗癌、抗哮喘以及保护神经的作用[16]。核桃多酚对低密度脂蛋白胆固醇的氧化有很好的抑制作用[17]。没食子酸、儿茶素、表儿茶素等对低密度脂蛋白胆固醇的氧化有较好的抑制作用[18]。酚类化合物对低密度脂蛋白胆固醇氧化的抑制作用可能是酚类对自由基的清除或者与金属离子螯合有关[19]。

2.4 抗氧化活性试验

采用FRAP、DPPH和ABTS法测定山核桃仁多酚的抗氧化性，结果见图6。由图6可知，FRAP、DPPH和ABTS法测得山核桃仁多酚的抗氧化活性分别为108.94、184.71和175.92 μmol Trolox/g，与山核桃壳多酚的抗氧化活性相比，山核桃仁多酚的FRAP、DPPH和ABTS抗氧化活性比核桃壳多酚强[20]。研究发现，总酚含量与其抗氧化能力相关，总酚含量高，则其抗氧化能力强，酚类对预防氧化应激相关疾病有重要的作用[14]。总酚与FRAP、DPPH以及ABTS的相关性较强；没食子酸与FRAP、DPPH以及ABTS的相关性较强；异槲皮苷与FRAP的相关性较强；阿魏酸与ABTS的相关性较强[21]。

3 小结

通过单因素和正交试验得出山核桃仁多酚提取的优化工艺条件为料液比1∶50，乙醇体积分数30%，超声20 min，提取温度35 ℃。山核桃仁中槲皮苷的含量最高，达到3221.31 μg/g（DW）；其次是芦丁，其含量为299.51 μg/g（DW）。FRAP、DPPH和ABTS 3种抗氧化活性测定方法表明，山核桃仁多酚是很好的抗氧化剂。

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