混菌固态发酵对紫苏饼粕营养特性的影响

田海娟　王晓旭　孙天瑶

摘要：利用纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）与马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）对紫苏（Perilla frutescens）饼粕进行混菌的固态发酵，对其发酵后的产品进行理化分析。结果表明，在接种量为5%，混菌发酵温度为33 ℃的条件下，发酵2 d，发酵后紫苏饼粕中粗蛋白升高3.79个百分点，纤维素降低2.80%，总黄酮升高15.53%。

关键词：紫苏（Perilla frutescens）饼粕；混菌发酵；营养特性；变化规律

中图分类号：S816.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）11-2105-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.028

Abstract： Bacillus natto and Kluyveromyces marxianus as the strains of mixed bacteria solid-state fermentation of perilla（Perilla frutescens） seed meal， the physical and chemical analysis of its fermentation products were studied. The results showed that under that condition of inoculation quantity 5%， the optimal temperature 33 ℃，after 2 days mixed bacteria solid-state fermentation， the increase rate of perilla seed meal crude protein was 3.79 percentage points， cellulose degradation rate was 2.80%， and flavonoids increased at a rate of 15.53%.

Key words： perilla （Perilla frutescens） seed meal； mixed fermentation； nutritional properties； change rule

紫苏子，又称苏子、赤苏子，是紫苏（Perilla frutescens）的干燥成熟果实，是一种重要的油料经济作物。紫苏子性温，无毒，生吃可以止渴润肺；熟食补中益气、祛痰止咳、降血压、平哮喘[1]。紫苏子中含有大量的脂肪、蛋白质、纤维素、非氮物质、灰分，其中油脂含量约为45%～55%，蛋白质含量占25%。紫蘇子中还含有约12.19 mg/g的黄酮[2]，黄酮类化合物具有多种药理作用，可以降血脂和胆固醇，改善血液循环，增强免疫力，还可以抗炎、扩张冠状动脉、增加冠脉流量、改善高血压等，具有一定的抗肿瘤和保肝等作用。紫苏子炼油后获得的副产品主要是紫苏饼粕。紫苏饼粕主要用作饲料，直接饲喂营养成分的利用率不高，造成了浪费，对紫苏饼粕进行发酵研究，可以为更好地利用和开发紫苏饼粕提供依据。

纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）的原始菌株是枯草芽孢杆菌的一个亚种，是从日本传统食品纳豆中分离出来的[3]，纳豆芽孢杆菌产生的代谢物纳豆激酶具有溶血栓、抗肿瘤、抗氧化性及预防骨质疏松等作用。纳豆芽孢较为稳定，在酸性胃环境中仍然保持稳定；在肠道中不增值，只在肠道上段迅速发育转变成代谢活跃的营养型细胞[4]，抑制肠杆菌和肠球菌等的生长，能促进双厌氧菌的生长。纳豆芽孢杆菌在肠道中酸化有利于铁、钙等矿物质的吸收[5]。马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）是藏灵菇中的一种重要菌。马克斯克鲁维酵母菌中含有多种对人体健康有益的活性物质，包括β-葡聚糖。经研究发现，酵母β-葡聚糖具有刺激免疫、降低胆固醇、抗氧化、抗菌和抗肿瘤等功能。本试验利用纳豆芽孢杆菌与马克思克鲁维酵母菌对紫苏饼粕进行混菌的固态发酵，对其发酵后的产品进行理化分析，以期为紫苏饼粕的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验菌种 纳豆芽孢杆菌、马克思克鲁维酵母菌由吉林农业大学生物制造创新实验室提供。

1.1.2 原料与试剂 紫苏油粕（吉林洮南百群食品科技有限公司）；牛肉膏、蛋白胨、氯化钠（分析纯）、葡萄糖、甲基红（分析纯）、溴甲酚绿（分析纯）、硝酸铝（分析纯）（天津市北辰方正试剂厂）；MRS培养基（广东省环凯微生物有限公司）；无水硫酸铜、硼酸（天津市光复精细化工研究所，分析纯）；硫酸钾、盐酸、浓硫酸、无水乙醇、甲醇（北京化工厂，分析纯）；氢氧化钠（上海集团化学试剂有限公司，分析纯）；纤维素标准品、芦丁标准品（长春生物制品所）；蒽酮（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；亚硝酸钠（广东省台山市化工厂，分析纯）。

1.1.3 仪器与设备 BSC-1300IIA2型超净工作台（ 苏净苏州安泰空气技术有限公司）；ZHWY-1112C型双层超大容量恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；DNP-9052BS-Ⅲ型电热恒温培养箱（上海双旭电子有限公司）；FD-1-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；SH220N型石墨消解仪、K1100型海能全自动凯氏定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）；MS7-H550-Pro型磁力搅拌器（上海创奕科教设备有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS110S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；YXQ-LS-18SI型手提式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化

1）培养基的制备。LB培养基：牛肉膏2.5 g、蛋白胨5 g、氯化钠2.5 g、葡萄糖5 g，溶解于500 mL去离子水中，pH 7.0～7.2。MRS培养基：称取固态MRS培养基26.2 g，加热溶解于500 mL去离子水中。将制备好的LB培养基与MRS培养基分装至100 mL的三角瓶中，每个三角瓶50 mL，瓶口用报纸包好，扎紧，一同放入高压蒸汽灭菌锅中，121 ℃，20 min。灭菌后放冷，备用。

2）马克思克鲁维酵母菌的活化。在超净工作台上，将需要使用的全部仪器设备放入超净工作台，除菌种以外。使用前用酒精棉擦拭超净工作台台面，打开紫外灯，照射30 min，关闭紫外灯，打开送风，用酒精棉再次擦拭台面并擦手，开始试验操作。准确吸取0.5 mL马克思克鲁维酵母菌于50 mL MRS培养基的三角瓶中，瓶口捆绑的不要太紧。摇瓶30 ℃培养18 h，此为一代菌液。

3）纳豆芽孢杆菌的活化。由于纳豆芽孢杆菌为粉末状，故在接菌时要关闭送风，点燃酒精灯。靠近酒精灯，将装有纳豆芽孢杆菌的胶囊打开，加少量纳豆芽孢杆菌粉末于含50 mL LB培养基的三角瓶中，棉塞过火，塞好棉塞，盖好胶囊，三角瓶口包上报纸，用绳子捆好，不要捆绑太紧。在操作过程中不得远离酒精灯，避免染菌。将接菌的三角瓶放入摇床中，36 ℃培养18 h，此为一代菌液。

1.2.2 菌种的传代培养 分别取1%一代菌液于各自的培养基中，培养条件同上，此为二代菌液。

1.2.3 原料处理 紫苏子经超临界CO2技术（压力25 MPa，温度40 ℃，流量20 L/h，1 L萃取釜萃取90 min）萃取紫苏子油，剩下的紫苏饼粕进行超微粉碎处理，冷冻保藏。准确称取40 g紫苏饼粕超微粉放入蓝盖瓶中，121 ℃、20 min高压蒸气灭菌后备用。

1.2.4 单菌固态发酵试验 无菌条件下进行，每个蓝盖瓶中加入60 g无菌水（紫苏子粕与水的比例为1.0∶1.5，g∶mL，下同），用玻璃棒充分搅拌均匀。接种5%（即5 mL）纳豆芽孢杆菌菌液，分别放入30、33、36 ℃恒温培养箱中培养2 d。分别接入5%马克思克鲁维酵母菌，其接种量、培养温度和培养时间与纳豆芽孢杆菌相同。发酵后灭菌冻干备用。

1.2.5 混菌发酵试验 取3个含有与无菌水混合的紫苏饼粕蓝盖瓶，每个加入5%（即5 mL）混合菌液，纳豆芽孢杆菌与马克思克鲁维酵母菌的比例为1∶1。将3个接菌的蓝盖瓶分别放入30、33、36 ℃的恒温培养箱中培养2 d，做3个未接菌的空白，培养条件同上，发酵后灭菌冻干备用。

1.2.6 发酵产品成分分析 按照试验设定的发酵条件对紫苏饼粕进行发酵，分析其粗蛋白质、纤维素、总黄酮含量的变化。

1）粗蛋白质含量测定。根据GB/T 50095-2010检测紫苏饼粕的粗蛋白质含量。

2）纤维素测定。纤维素测定采用比色法。准确吸纤维素标准溶液5.0 mL至50 mL容量瓶中，加去离子水至刻度线，混合均匀，即纤维素含量0.1 mg/mL。绘制纤维素标准曲线，如图1所示。测定待测样品吸光度，根据标准曲线计算样品的纤维素含量。

3）总黄酮含量的测定。配制芦丁标准液，芦丁含量0.2 mg/mL。标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准液1、2、3、4、5 mL分别于25 mL容量瓶中，各加水至5 mL；然后加1 mL 5%亚硝酸钠溶液，混合均匀，静置6 min；再加10%硝酸铝1 mL，混合均匀，静置6 min；加氢氧化钠溶液10 mL，再加去离子水稀释至刻度线，混合均匀，静置15 min，以相应的试剂做空白试验。使用紫外-可见分光光度计在500 nm处分别测定5个标准液的吸光度。横坐标为芦丁浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线如图2所示。

准确称取样品0.5 g于25 mL比色管中，加甲醇至刻度线，置于超声波清洗器中，温度为70 ℃，功率为70%，提取70 min[6]。提取后溶液过滤，滤液置于50 mL容量瓶中，滤渣用甲醇冲洗后转移至容量瓶中，用甲醇定容。按照标准曲线制备的方法进行检测并计算其总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 混菌发酵粗蛋白质含量的变化

不同温度混菌发酵紫苏饼粕粗蛋白质含量的变化如图3所示。发酵后的紫苏饼粕粗蛋白质含量均有所提高，其原因可能是微生物中含有20%左右的干物质，干物质由蛋白质、碳水化合物、核酸矿物质等物质组成，随着发酵时间的增长微生物也随之增长，样品中微生物的干物质增多，再加上菌种自身的菌体蛋白质含量较高，经发酵后，菌种大量繁殖，致使总的粗蛋白质含量升高；且微生物生长繁殖的过程中中间代谢产物的生成也会增加粗蛋白质的含量。从图3可以看出，混菌发酵的紫苏饼粕比未经发酵的、经纳豆芽孢杆菌与马克思克鲁维酵母菌单菌发酵的粗蛋白質含量高；不同温度下的混菌固态发酵紫苏饼粕粗蛋白质的含量由多至少依次为33 ℃>30 ℃>36 ℃。

2.2 混菌发酵纤维素含量的变化

不同温度混菌固态发酵紫苏饼粕纤维素含量的变化如图4所示。固态发酵后的纤维素含量降低，其原因是微生物的生长繁殖将纤维素作为碳源，将大分子的纤维素分解为小分子加以吸收利用，而使纤维素含量下降。从图4可以看出，混菌发酵比未发酵、经纳豆芽孢杆菌及马克思克鲁维酵母菌单菌发酵的纤维素含量低；不同温度下混菌发酵紫苏饼粕纤维素含量由少至多依次为33 ℃>30 ℃>36 ℃。

2.3 混菌发酵总黄酮含量的变化

不同温度混菌固态发酵紫苏饼粕总黄酮含量的变化如图5所示。经固态发酵后的紫苏饼粕其总黄酮含量升高，其原因是紫苏饼粕发酵产生了一些物理或生物化学变化，微生物可以改变紫苏饼粕其原有的化学成分含量，也可能与微生物的代谢有关。从图5中可以看出，混菌发酵比未发酵、经纳豆芽孢杆菌及马克思克鲁维酵母菌单菌发酵的总黄酮含量高；不同温度下混菌发酵紫苏饼粕总黄酮含量由多至少依次为33 ℃>30 ℃>36 ℃。

3 小结

试验利用纳豆芽孢杆菌与马克思克鲁维酵母菌对紫苏饼粕进行单菌与混菌的固态发酵，对其发酵后的紫苏饼粕进行理化分析。结果显示，经微生物固态发酵后的紫苏饼粕其粗蛋白质及总黄酮含量均有不同程度升高，纤维素含量有所下降，经过对比得知混菌发酵优于单菌发酵，混菌发酵最佳温度为33 ℃。紫苏饼粕接种5%的混菌，33 ℃发酵2 d：粗蛋白质含量由30.74%上升到34.53%，升高3.79个百分点；纤维素含量由384.97 mg/g下降到374.38 mg/g，降低2.80%；总黄酮含量由11.42 mg/g上升到13.52 mg/g，升高15.53%。

参考文献：

[1] 李英霞，彭广芳.紫苏子的本草考证[J].中医药研究，1996（3）：60-61.

[2] 邹 茜.浅谈紫苏不同居群不同部位总黄酮含量的差异[J].当代医药理论，2014（9）：32-34.

[3] 布坎南R E，吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册[M].第八版.中国科学院微生物研究所《伯杰氏的菌鉴定手册》翻译组，译.北京：科学出版社，1984.

[4] 刘学剑.微生态理论与绿色饲料添加剂的开发应用[J].湖南饲料，2000，59（5）：2-7.

[5] 王旭冰，娄永江.纳豆芽孢杆菌的开发与利用[J].中国调味品，2010（4）：28-31，34.

[6] 宋继伟.紫苏籽饼粕黄酮类物质的提取及抗菌性研究[D].长春：吉林农业大学，2014.