烘烤期烟叶霉烂病的侵染源与防治

王永栋 顾钢 肖顺 王鹏 徐茜 林勇 张绍升

摘要[目的]明确烘烤期烟叶霉烂病的症状、病因、侵染源和防治措施。[方法]通过病原形态学观察、生物学特性观察和ITS-PCR检测分析，对烘烤期烟叶霉烂病的病原进行鉴定，并用二氧化氯和三氯异氰脲酸对烟柄喷雾或熏蒸装烟后的烤房，研究其对烘烤期烟叶霉烂病的防治效果。[结果]烘烤期烟叶霉烂病的病原鉴定为米根霉（Rhizopus oryzae）。利用PSA平板采集烤房内外及烟叶表面的微生物，米根霉广泛存在于烤房内外的环境中，能在烤房内存活和积累成为重要侵染源。用二氧化氯和三氯异氰脲酸对烟柄喷雾或熏蒸装烟后的烤房，结果显示熏蒸法对烘烤期烟叶霉烂病的防治效果在62.62%～69.57%。[结论]为烟叶霉烂病的有效防治提供了理论依据。

关键词烟叶霉烂病；二氧化氯；三氯异氰脲酸；防治

中图分类号S432文献标识码A文章编号0517-6611（2017）19-0138-05

Control and Infection Source of Tobacco Leaf Mildew Rot during Fluecuring Period

WANG Yongdong1， GU Gang2， XIAO Shun1， ZHANG Shaosheng1* et al

（1.College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002；2.Fujian Institute of Tobacco Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003）

Abstract[Objective] The aim was to explore the symptoms， causes， infection source and control ways of tobacco leaf mildew rot disease. [Method] The pathogen of tobacco leaf mildew rot disease was identified by the ITSPCR sequence analysis combined the morphological characters and biologic characters. The disinfectants chlorine dioxide and trichloroisocyanuric acid were used to control the disease by spraying to tobacco stalks and fumigation in curing barns. [Result] The pathogen was identified as Rhizopus oryzae. The microbial flora in the curing surroundings and tobacco leaf were isolated and analyzed by PSA plate culture， the results showed Rhizopus oryzae was widespread in the curing barns and their surroundings， the fungi could accumulate in the curing barns and were the important infection sources. The disinfectants chlorine dioxide and trichloroisocyanuric acid were used to control the disease by spraying to tobacco stalks and fumigation in curing barns， the disinfectants fumigation could effectively control the disease， and the control effect were up to 62.62%-69.57%. [Conclusion] The results provide theoretical basis for the control of tobacco leaf mildew rot disease.

Key wordsTobacco leaf mildew rot disease；Chlorine dioxide；Trichloroisocyanuric acid；Control

煙叶烘烤过程中常常发生烤坏烟。烤坏烟的种类多样，常见类型有烤青烟、蒸片烟、黑糟烟、挂灰烟、洇筋洇片烟、烤红烟；烤坏烟的主要原因与烟叶的成熟度、含水量以及烤房烘烤期间温度和湿度失调等物理因素有关[1-2]。由微生物引起的烟叶霉烂主要发生于仓储期，病原菌主要是曲霉（Aspergillus spp.）、青霉（Penicillium spp.）、根霉（Rhizopus spp.）、毛霉（Mucor spp.），发病条件是环境湿度和烟叶含水量过高[3-5]。2010年云南省报道在大多数红花大金元种植烟区，烟叶烘烤过程中叶柄发霉造成很大损失[6]。近几年在福建省红花大金元烤烟生产区的烟叶在烘烤变黄阶段发生霉变烂叶现象，不少烤房损失严重。曾婷英等[7]对福建省烘烤期烟叶霉烂的病原菌进行鉴定，首次确认烘烤期烟叶霉烂是由米根霉（Rhizopus oryzae Went et Geerligs）引起的侵染性病害，将该病害命名为烟叶霉烂病。据调查烘烤期烟叶霉烂病在其他烟区也常发生，为了有效防治病害，笔者对烟叶霉烂病的侵染来源和发病条件进行了调查，并结合实际生产开展了病害防治技术研究。

1材料与方法

1.1材料

供试消毒剂：二氧化氯（10%食品级）、三氯异氰脲酸（有效氯含量50%）。

1.2方法

1.2.1不同烘烤方式的烟叶霉烂病调查。

调查地点：福建省政和县杨源乡密集型烤房。烤烟品种：红花大金元。烘烤方式：①挂竿密集烘烤；②散叶烘烤。根据肉眼观察结果记述不同烘烤方式发生的烟叶霉烂病，描述病害症状。

1.2.2烟叶霉烂病的侵染源调查与鉴定。

1.2.2.1烟叶带菌调查。

切取待烤的红花大金元的健康烟叶叶柄和变黑坏死的烟叶叶柄，各取20根样本，取上部3～5 cm叶柄，用灭菌水表面冲洗3次，置于水琼脂平板上30 ℃培养箱中保湿培养，定期观察，待长出菌丝时镜检。

1.2.2.2烘烤前后烤房内外环境带菌收集。采用PDA平板（马铃薯葡萄糖琼脂平板）捕捉和收集空气中的孢子。烤房内将PDA平板置于烘烤架的上、中、下不同高度，每种高度放5皿。烤房外将PDA平板置于烤房门外、过道、烟堆、烟堆旁边，每处各放5皿。将PDA平板暴露于空气中15 min后，盖好培养皿并用胶带封口带回实验室置于28 ℃培养箱中倒置培养，24～48 h计数培养皿中的菌落数并经显微镜检查。

1.2.2.3侵染源鉴定。

（1）形态学鉴定。用解剖针挑取烤房内PDA平板收集的根霉菌霉层置于载玻片的乳酚油中，制成临时玻片标本，于光学显微镜下观察病原菌形态特征，根据参考文献[8]进行病原菌种类鉴定。

（2）分子生物学鉴定。采用SDS法提取病原菌DNA[9]，采用真菌rDNA通用引物ITS1、ITS4对菌丝体的ITS区进行PCR扩增。ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。120 V电泳30 min，确定扩增到产物后，将PCR产物送至生物技术公司测序，采用计算机分析软件MEGA 3.1及NCBI核酸数据库，将所得rDNA-ITS区序列进行拼接，进行对比分析。

1.2.3病害防治研究。

1.2.3.1药剂防治方法。

①消毒剂地面泼洒熏蒸处理。开烤前8 h使用消毒剂80倍液对烤房四周内壁进行喷雾，用药量0.5 g/m3；待烟叶挂竿安装上烤后，用消毒剂50倍液泼洒于烤房地面，地面用药量为12.0 g/m2，密闭装烟室30 min后按操作规程开烤。

②消毒剂烟雾熏蒸处理。即烘烤前8 h将盛有100 g消毒剂铝制容器置于煤炭炉上加热，迅速关好门窗并进行密闭处理，熏蒸5 h后透气，按规程装烟开烤。

③烟叶叶柄药剂处理。烤前对已捆绑挂竿的烟叶于叶柄上喷施消毒剂，消毒剂稀释50倍，使用量为1.2 g/m3，晾干1 h后上架按规程开烤。

④对照。处理或喷清水处理。

1.2.3.2防治效果调查。

烘烤结束时调查发病情况，根据分级标准计算病情指数和防治效果。试验数据采用Excel、SPSS软件进行统计和分析。

烟叶霉烂病分级标准：

0级，正常烟叶；

1级，叶柄发霉小于1 cm，叶片不发病；

2级，叶柄发霉大于1 cm，叶片不发病；

3级，叶柄发霉且叶片发霉面积在1%～25%；

4级，叶柄发霉且叶片发霉面积在26%～50%；

5级，叶柄发霉且叶片发霉面积在50%以上。

病情指数=（各级病叶数×相应级数）调查总叶数×5×100

防治效果=对照区病情指数-处理区病情指数对照区病情指数×100%

2结果与分析

2.1烟叶霉烂类型

根据调查结果分析，烟叶变黄排湿过程中烟叶霉烂与烟叶表面湿度、含水量及伤口有关。烤烟不同烘烤方式其霉烂症状有2种类型：①叶柄霉烂型。俗称“霉头”，发生于烟叶扎把挂竿烘烤的烤房。霉变从含水量高的叶柄采摘伤口开始发生，沿着叶柄逐渐向叶片主脉、侧脉及叶片扩展，导致葉片大面积发霉腐烂（图1-A、B）。②叶片霉烂型。发生于烟叶散叶插签装烟密集烘烤的烤房。由于密集叠放叶片中央湿度大且排湿不畅，霉变从插签的伤口处开始发生，向伤口四周及上下叶片扩展，导致成堆叶片霉烂（图1-C、D）。

2.2烟叶霉烂病的侵染源

2.2.1烟叶携带根霉菌调查结果。

将待烤的烟叶的叶柄样本置于水琼脂中30 ℃恒温培养箱中保湿培养，4～7 d未携带病原菌的健康叶柄依旧保持着新鲜的绿色（图2-A），未携带病原菌的腐烂烟叶柄长出许多细菌和部分杂菌（图2-C）。携带有病原菌的健康烟柄和腐烂烟柄均长出灰黑色菌丝和孢子囊，孢子囊初期为乳白色到后期变为黑褐色（图2-B、D）。健康叶柄根霉菌带菌率为20%～30%，腐烂叶柄根霉菌带菌率为10%～20%（表1）。

安徽农业科学2017年

2.2.2烤房及烤房周边空气中根霉菌调查结果。

开烤前后用PDA平板捕捉烤房内外空气中的根霉菌（图2-E）。分离结果表明，烤房内外空气中均存在根霉菌。烤房内根霉菌广泛分布于不同高度的空间中；烤房外根霉菌存在于较高处的空间。烤房内烘烤后的根霉菌的数量显著多于烘烤前，烤房周围的根霉数量也较烘烤前多，说明在烘烤后烟叶大量发生霉烂，增加了烤房内外环境中根霉菌的种群密度（表2）。

2.2.3根霉菌种类鉴定。

对烤房内捕捉分离的根霉菌进行形态学鉴定和生物学测定，结合前期的鉴定结果[7]，确定为米根霉（Rhizopus oryzae Went et Geerligs）。

用真菌rDNA通用引物ITS1、ITS4对烟叶上根霉菌菌株的ITS区进行PCR扩增，得到1条约600 bp的产物（图3）。通过测序、拼接及比对及分析，该序列与Genbank上的AY21368等菌株划在同一个分枝，同属于米根霉（图4）。

2.3烟叶霉烂病的防治

试验结果表明，二氧化氯和三氯异氰脲酸能有效防治烘烤期烟叶霉烂病，明显降低病害的严重程度（表3和图5）。烤房熏蒸处理效果优于烟草叶柄喷雾消毒处理；用二氧化氯和三氯异氰脲酸于开烤前烤房喷雾消毒，装烟后烤房地面泼洒熏蒸可以得到较好的防治效果；三氯异氰脲酸烟雾熏蒸效果优于泼洒熏蒸。

3讨论

烟叶烘烤期霉烂病是由米根霉侵染引起的一种新的侵染性病害，是烟叶烘烤期的重要病害，对烤烟的产量和质量构成重大损失。过去将烟叶烘烤期霉烂称为“霉头”，指叶柄头部发霉。研究结果表明，烘烤期的高温、烟叶表面的高湿度和烟叶组织内较高含水量、烟叶创伤和采摘伤口是诱发烟叶霉变腐烂的重要条件，因此，烟叶烘烤期霉烂症状与烟叶烘烤方式有关。挂竿烘烤烟叶病害先从叶柄开始发生，其症状为“叶柄霉烂型”，散叶烘烤烟叶病害从叶面签插伤口处开始发生，其症状为“叶片霉烂型”。病害症状的系统观察和描述为病害诊断提供了依据。

迄今为止，烟叶烘烤期霉烂病仅在红花

大金元烤烟品种上发生，其他烤烟品种鲜见该病的报道，

烟叶烘烤期霉烂病在烤房内高温高湿的条件下发生，烤烟又是供人们吸品的特殊作物，必须防止化学药物对产品造成残留和污染。因此，需要研制安全高效和适用的防治技术。利用二氧化氯和三氯异氰脲酸熏蒸烤房和挂竿烟叶，对烟叶霉烂病具有很好的防治效果。二氧化氯为联合国世界卫生组织（WHO）確认的 A1 级杀菌消毒剂；三氯异氰尿酸广泛用于饮食、医疗卫生、水处理等行业[10-12]。这2种消毒剂在烟草上使用具有无毒无残留、安全高效等特点，建议在烟草生产中推广应用。该防治试验仅在挂竿烘烤的烤房进行，计划进一步开展熏蒸技术（药剂挂袋熏蒸，烟雾熏蒸）和其他烘烤方式（如散叶烘烤）防治技术研究。

4结论

烟叶霉烂病病原菌米根霉 （Rhizopus oryzae）广泛分布于烟叶表面和烤房内外的环境及空气中，是病害的初侵染源。米根霉是高温菌，可在烘烤后的烤房内存活和积累。烤房内烟叶霉变后产生的病原菌可以成为后烤烟叶的再侵染菌源。

采用二氧化氯和三氯异氰脲酸在烟叶烘烤前期（开烤第1天）熏蒸处理烤房和挂竿烟叶，对烟叶霉烂病的防治效果在62.62%～69.57%，效果显著。

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