云南牛干巴加工过程中生物胺变化规律

刘姝韵　孙灿　王桂瑛　程志斌　肖蓉　廖国周

摘 要：以黄牛后腿肉为原料，采用传统工艺加工云南牛干巴，分别在腌制前、腌制中期、腌制后期、成熟1 个月、成熟2 个月和成熟3 个月6 个加工阶段取样，用离子色谱法分析测定其生物胺含量和变化情况。结果表明：云南牛干巴样品中共检测出7 种生物胺，分别是腐胺、尸胺、组胺、亚精胺、苯乙胺、精胺和酪胺。在各个加工阶段，精胺的含量都是最高的，最大值为（227.05±18.57） mg/kg，其次是腐胺与酪胺，最大值分别为（44.32±31.52） mg/kg和（63.70±3.80） mg/kg。牛干巴生物胺总量从腌制前到腌制中期显著减少（P<0.05），从腌制中期到成熟3 个月阶段显著增加，与腌制前相比，成熟2 个月至成熟3 个月时牛干巴的生物胺总量显著增加（P<0.05），在成熟3 个月时达最大值（（392.36±35.59） mg/kg），可见生物胺主要在牛干巴成熟阶段产生且该阶段含量最多。

关键词：云南牛干巴；生物胺；变化规律；离子色谱法

Abstract： Yunnan dry-cured beef was produced from hindquarter meat from yellow cattle by the traditional process. Samples were collected at six different processing stages： before curing， at the middle and late stages of curing， after ripening for one， two and three months， and analyzed for quantitative changes of biogenic amines by ion chromatography. Results demonstrated that a total of seven biogenic amines， putrescine， cadaverine， histamine， spermidine， phenylethylamine， spermine， tryamine， were detected in the collected samples. Spermine was the most abundant biogenic amine for all sampling stages， the maximum value of which was （227.05 ± 18.57） mg/kg， followed by putrescine and tryamine， with maximum values of （44.32 ± 31.52） and （63.70 ± 3.80） mg/kg， respectively. A significant reduction in the total amount of biogenic amines was observed comparing samples collected before curing and at the middle curing stage （P < 0.05）， whereas a significant increase was found for samples ripened for three months. Compared with uncured samples， the total amount of biogenic amines was significantly increased in the ones ripened for two and three months （P < 0.05） with the maximum value

（（392.36 ± 35.59） mg/kg） being observed after three months of ripening. It is clear from this study that biogenic amines were mostly produced during the ripening stage of Yunnan dry-cured beef， which yielded the highest total biogenic amines content.

Key words： Yunnan dry-cured beef； biogenic amines； change regulation； ion chromatography

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201706002

中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）06-0007-06

引文格式：

刘姝韵， 孙灿， 王桂瑛， 等. 云南牛干巴加工过程中生物胺变化规律[J]. 肉类研究， 2017， 31（6）： 7-12. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201706002. http：//www.rlyj.pub

LIU Shuyun， SUN Can， WANG Guiying， et al. Changes of biogenic amines during processing of Yunnan dry-cured beef[J]. Meat Research， 2017， 31（6）： 7-12. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201706002. http：//www.rlyj.pub

生物胺（biogenic amines，BAs）是由相應的氨基酸在微生物脱羧作用下产生的一类具有生物活性的低分子质量有机碱性化合物，其主要存在于发酵乳制品、酒类、肉制品及水产品等富含蛋白质的食品中[1]。根据含量和毒性，食品中常见的生物胺主要包括组胺、酪胺、苯乙胺、色胺、尸胺、精胺和亚精胺等[2-3]。适量的生物胺摄入对人体的各种生理机能有调节作用，但过量摄入会引发偏头痛、心悸、恶心、呕吐、腹泻及血压变化等一系列不良症状，严重时可导致脑出血甚至死亡，此外如果食品中同时含有亚硝酸盐，还可能会与生物胺反应生成致癌的亚硝胺类化合物[4-5]。近年来，关于生物胺的研究一直是食品安全领域的热点问题。

云南牛干巴是云南地区的一种传统民族肉制品，它是以黄牛后腿肉为原料，经腌制、晾晒、风干发酵而成的块状自然发酵肉制品[6]。牛干巴制作工艺考究、肉质酥脆、风味独特且营养丰富，但作为一种传统的腌腊肉制品，其在加工过程中主要依靠环境中的微生物生长来进行发酵，这也为生物胺的形成提供了有利条件，降低了牛干巴的食用安全性[7]。目前云南牛干巴加工过程中生物胺的变化规律鲜有报道，本研究采用离子色谱法测定云南牛干巴加工过程中6 个工艺点生物胺的种类与含量变化，旨在为牛干巴品质及安全控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

经检验合格的新鲜黄牛后腿肉（剔除筋膜） 云南省昆明市威远街农贸市场。

食盐 云南盐化股份有限公司；硝酸钠（食品级） 中国医药集团总公司；VC（食品级） 昆明振华制药厂；甲磺酸（methanesulfonic acid，MSA）（分析纯，纯度99%）梯度淋洗液 上海阿拉丁试剂有限公司；NaOH、腐胺、尸胺、组胺、亚精胺、苯乙胺、精胺、酪胺标准品 Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm） 美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

BS11OS精密分析天平 北京赛多利斯天平有限公司；

Centrifuge5415D离心机 德国Eppendorf股份公司；DionexICS-3000离子色谱仪 美国Thermo Fisher公司；EG40淋洗液自动发生器 美国戴安公司；MB550匀

浆机 瑞士Wiggens公司；Milli-Q超纯水制备系统

美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 牛干巴传统加工工艺

取新鲜黄牛后腿肌肉5 块，于11月份开始腌制，温度在0～10 ℃之间，腌制15 d左右。具体加工工艺如下：黄牛后腿肉→冷凉→称质量→擦腌制料→入坛压实，密封腌制→晾晒→堆码挤压→风干→成品→切片→真空包装

腌制料：食盐（40 g/kg）、硝酸钠（0.4 g/kg）、VC（0.01 g/kg）。

1.3.2 样品前处理

分别在腌制前（腌制第0天）、腌制中期（腌制第7天）、腌制后期（腌制第15天）、成熟1 个月、成熟2 个月及成熟3 个月6 个工艺点进行取样，每个工艺点取5 个样品。

采用周勇等[8]的方法进行样品前处理：将样品通过匀浆机进行彻底粉碎、匀浆，取2.0 g匀浆后的样品，加入20 mL 100 mmol/L的MSA，超声提取30 min，在4 ℃、8500 r/min条件下离心10 min，取上清液2 mL，加入1 mL乙腈和1 mL去离子水，涡旋混匀，离心后取上层液体过0.22 μm滤膜后上机测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Ionpac CG17保护柱（50 mm×4 mm）+Ionpac CS17分析柱（250 mm×4 mm）；柱温：30 ℃；MSA梯度淋洗液（淋洗液梯度程序如表1所示）；流速：1.0 mL/min；抑制电导检测：抑制电流103 mA，检测池温度35 ℃；紫外检测波长：276 nm；进样量：25 μL。

1.4 数据处理

采用Excel和SPSS 19.0软件进行数据处理。所有样品均作3 次平行，测定结果以平均值±标准差表示，实验数据采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）进行邓肯（Dunkens）差异分析。

2 结果与分析

2.1 生物胺标准色谱图

用离子色谱法对腐胺、尸胺、组胺、亚精胺、苯乙胺、精胺6 种生物胺的标准溶液（质量浓度均为10.0 mg/L）

进行测定，外标法定量，抑制电导检测；采用紫外检测器对酪胺标准溶液（质量浓度为10.0 mg/L）进行分析，外标法定量。生物胺标准溶液的分离情况如图1～2

所示。

2.2 方法的线性范围与检出限

用超纯水将各生物胺标准品稀释至不同质量浓度，各质量浓度样品分别测定3 次。以标准溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其线性范围、相关系数和检出限（信噪比RS/N=3）如表2所示。

2.3 方法的重复性

对同一样品按照相同的样品前处理和色谱条件平行测定5 次，考察方法的重复性。样品中添加的7 种生物胺标准溶液的质量浓度均为10.0 mg/L。由图3～4和表3可知，7 种生物胺的峰面积和保留时间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别低于5.00%和1.00%，说明此方法重复性较好。

2.4 加标回收率和精密度

称取待测样品5.0 g（精确到0.000 1 g）于50 mL聚丙烯离心管内，分别对样品进行0.25、0.50、1.00、

2.00 μg/mL 4 个质量浓度水平的加标实验，每个添加水平平行测定3 次。样品加标图谱见图5～6。由表4可知，7 种生物胺的加标回收率为91.6%～109.3%，表明方法的测定准确度较高。

2.5 牛干巴加工过程中生物胺的含量

由表5可知，牛干巴样品中共检出7 种生物胺，分别是腐胺、尸胺、组胺、亚精胺、苯乙胺、精胺和酪胺。在各个加工阶段，精胺的含量都是最高的；腐胺在腌制前至腌制中期的含量低于检测限，在成熟2 个月时含量显著增加（P<0.05），并达到最大值（（44.32±31.52） mg/kg）；尸胺在整个腌制过程中均未检出，而在成熟3 个月时含量显著增加（P<0.05）；组胺随加工過程的进行含量先减少后增加，成熟2 个月时达到最大值（（10.14±1.77） mg/kg）；亚精胺的含量从腌制前到腌制中期显著减少（P<0.05），在腌制中期达到最小值，随后又显著增加（P<0.05）；苯乙胺从腌制前到成熟1 个月均未检出，随后含量显著增加（P<0.05），在成熟结束时达到最大值；精胺含量从腌制前到腌制中期显著减少（P<0.05），随后又显著增加（P<0.05），在成熟结束时达到最大值；酪胺含量在整个加工过程中不断增加，成熟3 个月时达到最大值（（63.70±3.80） mg/kg）。生物胺总量从腌制前到腌制中期显著减少（P<0.05），随后显著增加，在成熟3 个月时达最大值（（392.36±35.59） mg/kg），与腌制前相比，成熟2 个月至成熟结束期间生物胺总量显著增加（P<0.05），由此可知生物胺主要在成熟阶段产生并且在此阶段含量最高。

3 讨 论

本研究在牛肉腌制前（新鲜牛肉）中共检测到3 种生物胺，分别是亚精胺、精胺和组胺，除精胺外，其他2 种生物胺含量均較低。亚精胺和精胺普遍存在于鲜肉和肉制品中，而肉的新鲜度和微生物的生长情况对其他生物胺的产生有一定影响[9]。Lorenzo等[10]通过研究西班牙传统干腌肉制品Lacón中的生物胺，发现色胺和精胺是鲜肉中主要存在的生物胺；Ernández-Jover等[11]发现西班牙市售鲜肉及肉制品中均含有亚精胺（0.7～13.8 mg/kg）

和精胺（6.4～62.1 mg/kg）。本研究中腌制前牛肉的亚精胺和精胺含量分别为（28.37±0.40） mg/kg和（126.22±3.35） mg/kg，均高于已有研究中的含量。Halász等[12]认为腐胺的存在对精胺的含量有一定影响，因为腐胺在酶的作用下可以转化为精胺，且存在动态平衡。王桂瑛等[13]通过对宣威火腿进行生物胺变化规律的研究发现，宣威火腿发酵成熟时共检测到7 种生物胺，分别为色胺、苯乙胺、腐胺、酪胺、尸胺、亚精胺与精胺，整个加工过程均无组胺检出。本研究在牛干巴腌制过程中共检测到5 种生物胺，分别是腐胺、酪胺、亚精胺、精胺和组胺；在成熟阶段共检测到7 种生物胺，分别是腐胺、尸胺、组胺、亚精胺、苯乙胺、精胺和酪胺；腌制后期，除腐胺和组胺外，牛肉中各生物胺的含量均有明显增加的趋势，其中精胺含量增加最为显著。Trevino等[14]的研究表明，酪胺和腐胺是发酵牛肉香肠中主要的生物胺，后期也会检测到组胺、尸胺等。在部分发酵肉制品中，腐胺、酪胺、组胺及尸胺的总含量通常高于300 mg/kg，而在经过热加工处理的肉品中其含量变化较大（低于10 mg/kg）[15]。Favaro等[16]通过检测发酵香肠等腌腊制品，发现酪胺（104～295 mg/kg）、腐胺（97～331 mg/kg）和尸胺（6～81 mg/kg）是主要的生物胺，而牛干巴中酪胺、腐胺、尸胺的含量均在上述范围内。

组胺是腌腊肉制品中最重要的生物胺成分之一，其在生物胺中的生理毒性最强，因而对人类健康构成了较大的威胁[17]。美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）经研究确定了组胺的危害作用水平为50 mg/kg，并规定进口水产品的组胺含量不得超过50 mg/kg[18]；欧盟则规定鲭科鱼类及其他食品中的组胺含量不得超过100 mg/kg；ten Brink等[19]的研究表明，组胺的安全用量在100 mg/kg以下；我国则规定鱼类中组胺的含量必须低于1 000 mg/kg[20]。本研究中虽然各个阶段均有组胺检出，但其含量均在安全范围内。由于牛干巴腌制时需要装坛密封，此时腌制环境处于低氧状态，组胺在腌制阶段含量较低的原因可能是CO2抑制了具有氨基酸脱羧酶活性的微生物的生长。酪胺的毒性仅次于组胺，Stratton等[21]发现酪胺的安全用量为低于100 mg/kg，Roseiro等[22]发现苯乙胺可以增强酪氨酸脱羧酶活性。苯乙胺在生物胺中所占比例较低，故不会对生物胺总量产生影响，但Sandler等[23]发现当苯乙胺含量达到3 mg时会导致人产生偏头痛，目前国际上对苯乙胺的限量还没有严格规定。

肉品中微生物的组成、NaCl含量以及加工的温度、相对湿度与时间等条件影响着氨基酸脱羧酶及其他参与形成生物胺的酶的活性，而原料品质与生物胺的形成同样有着巨大的关联[24]。肉品腌制阶段是微生物的快速生长期，本研究中各生物胺在牛干巴腌制阶段的含量变化不明显，成熟过程中的含量却显著增加，原因可能是牛干巴的腌制时间均在寒露至立春时节，环境温度一般在0～10 ℃，低温是控制生物胺产生的有效手段。相关研究表明，脱羧酶在15 ℃时仍具有活性，高温能够加速游离氨基酸的积累，从而促进生物胺的形成[25]。在牛干巴成熟阶段，环境温度一般高于15 ℃，可以促进氨基酸脱羧形成生物胺，这可能是牛干巴在成熟过程中生物胺含量显著增加的原因。但也有研究表明，发酵肉制品中生物胺的积累主要是由于受到微生物的污染并且微生物大量繁殖的结果[26]。

牛干巴加工过程中生物胺总量的显著增加主要发生在成熟中后期。发酵肉制品在成熟后期及贮藏期，嗜酸乳酸菌或肠杆菌脱羧酶的活性会使生物胺含量增加[9]。

FDA规定食品中生物胺总量不得超过1 000 mg/kg。Eerola等[27]认为，发酵肉制品中血管活性生物胺（苯乙胺、组胺与酪胺）的总量低于200 mg/kg是产品具有较高品质的指标之一。本研究发现成熟风干后牛干巴中生物胺总量为392.36 mg/kg，其中血管活性生物胺的含量为

77.72 mg/kg，虽然远低于200 mg/kg，但是采用传统工艺加工的云南牛干巴仍需要在加工过程中采取适当的措施控制其中的生物胺含量，提高产品的食用安全性。

4 结 论

在云南牛干巴的加工过程中，生物胺主要在风干成熟阶段产生且含量最高。腌制前样品中共检出3 种生物胺，分别为组胺、精胺和亚精胺；腌制后期至成熟阶段大部分生物胺含量增加，成熟2 个月时共检出7 种生物胺，除腌制前检测出的3 种生物胺外，还有腐胺、尸胺、苯乙胺和酪胺，成熟结束时的生物胺总量达（392.36±35.59） mg/kg。为了进一步阐明牛干巴中生物胺的形成和累积机制，有必要对牛干巴加工过程中生物胺前体物的变化规律进行更加深入的探讨，为云南牛干巴的品质控制提供科学的理论依据。

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