Calumenin在成人脑胶质母细胞瘤中的表达及对U87细胞增殖与迁移的作用

康 鹏，张 鹏，王 宇

(1.首都医科大学附属北京天坛医院 神经外科，北京 100050；2.国家神经系统疾病临床医学研究中心，北京 100050)



临床医学研究

Calumenin在成人脑胶质母细胞瘤中的表达及对U87细胞增殖与迁移的作用

康 鹏1，2，张 鹏1，2，王 宇1，2

(1.首都医科大学附属北京天坛医院 神经外科，北京 100050；2.国家神经系统疾病临床医学研究中心，北京 100050)

目的 检测Calumenin在成人脑胶质母细胞瘤中的表达，并研究其对胶质瘤细胞系(U87细胞株)的细胞生物学作用。方法 收集成人脑胶质母细胞瘤手术切除标本(肿瘤组)和非脑部疾病死亡的人脑组织标本(对照组)，RT-qPCR检测CalumeninmRNA水平，免疫组化染色检测Calumenin表达；利用RNAi技术在U87细胞中特异性沉默Calumenin，观察细胞增殖及迁移变化。结果Calumenin在人脑胶质母细胞瘤中mRNA表达量明显高于对照组，其免疫组化染色显示Calumenin蛋白阳性；U87细胞敲除Calumenin后，细胞增殖、迁移能力均显著下降。结论Calumenin在人脑额叶胶质瘤母细胞瘤中确有表达，其对于胶质瘤细胞系的恶性细胞生物学特征发挥了重要作用，为胶质瘤的靶向治疗提供新的分子生物学靶点。

Calumenin；胶质母细胞瘤；U87；增殖；迁移

胶质瘤是中枢神经系统中起源于神经外胚层的一种原发肿瘤，其致死率与致残率均高[1]。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)2007年的脑胶质瘤的分级系统[2]将其分为低级别(LGC：Low Grade Glioma)和高级别(HGC:High Grade Glioma)两大类，其中低级别胶质瘤包括I级与II级，恶性程度相对较低；高级别包括III级间变星形与IV级胶质母细胞瘤等。目前胶质瘤的治疗主要依赖于手术切除，术后辅助放化疗，但整体预后仍不理想[3]。

钙腔蛋白(Calumenin，CALU)是一种位于哺乳动物体内的低亲和力钙结合蛋白，与其它四个成员RCN1、RCN2、RCN3和SDF4组成CREC家族，在内质网和高尔基体中表达[4-5]。既往研究显示CALU参与多个细胞生物学活动，包括钙循环、血管钙化、细胞迁移及凋亡过程。在鼠的大脑中，CALU仅在胚胎发育时期表达，到成年时其表达量下降甚至消失[6]。前期预实验提示CALU在胶质瘤标本中有表达，本研究拟对CALU在人脑胶质母细胞瘤组织与U87胶质瘤细胞系做进一步的检测，以明确其表达性质及在肿瘤恶性度中的分子生物学作用。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料、试剂与仪器 胶质瘤细胞系(U87)由北京协和医学院细胞库提供；Transwell 6孔板(孔径8um)购自Corning公司；CALU及β-actin引物、siRNA序列的设计及合成均由吉玛公司完成；反转录试剂盒购自全式金公司；MTT试剂盒、Trizol、Lipofectamine2000、DMEM、细胞培养试剂，购自Invitrogen公司；兔单抗-Calumenin抗体(ab137019)、HRP标记的山羊抗兔IgG(ab137027)购自abcam公司；苏木素(C6158)，购自Sigma公司。显微镜及图像分析系统购自Zeiss公司。蛋白电泳系统购自Bio-Rad；荧光定量PCR仪器为Applied Biosystems® QuantStudio® 3实时荧光定量PCR系统；SpectraMax 190光吸收型酶标仪来自Molecular Devices公司；细胞培养箱购自Thermo公司。

1.2 组织标本来源 人脑胶质母细胞瘤组织(肿瘤组)来源于北京天坛医院神经外科胶质母细胞瘤手术切除标本，入组标准为：①患者年龄18～65岁；②肿瘤位于端脑；③病理类型为胶质母细胞瘤(WHO IV级)；④术前未行放化疗。将术中所取的胶质母细胞瘤标本用PBS清洗干净，去除血块及坏死部分，再次用PBS缓冲液冲洗数次，保存在液氮中。对照组脑组织来源于北京协和医学院人脑组织库中非脑部疾病死亡的患者，其流程均按照国际标准脑组织保存方法进行处理与质控[7]。此次研究符合中国医学科学院北京协和医学院与首都医科大学附属北京天坛医院医学伦理要求，所有行肿瘤切除患者均知情同意。

1.3 反转录-荧光定量PCR(RT-qPCR)检测CALUmRNA水平 将部分脑组织标本用匀浆器充分研磨混匀后加入TRIzol，按照其说明书提取总RNA，采用紫外分光光度计测定其浓度与纯度，电泳检测其完整性，-80 ℃冰箱保存。通过反转录试剂盒将RNA进行反转录制作cDNA，简述如下。2 ug总RNA加入1 μL Olig(dT)，5×反转录缓冲液4 μL、dNTP混合物2 μL、RNA酶抑制剂20单位、反转录酶1μL、RNase-free水至20μL。反应条件为42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min，4 ℃保存。

采用SYBR Green PCR kit实时荧光定量PCR，按照说明书配制反应体系，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60°退火C15 s，72 ℃延伸15 s共40个循环；以β-actin作为内参，采用相对定量法计算CALUmRNA的相对表达量。CALU引物：Forward 5’- CCTCAGCTCAGTGACAAGGT-3’，Reverse 5’-CTGTCGCTCTACATCCTCGT-3’；β-actin引物：Forward 5’-CATTAAGGAG AAGCTGTGCT-3’，Reverse 5’-GTTGAAGGTAGTTTCGT GGA-3’。

1.4 免疫组化染色检测CALU蛋白表达 两组脑组织经固定、石蜡包埋切成厚10 μm切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。将组织浸入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)，于微波炉内微波辐射至沸腾15 min行抗原修复，再浸泡0.3%过氧化氢10 min。PBS漂洗后用3%血清白蛋白(BSA)封闭1 h，兔抗人CALU抗体(稀释比1∶500)4 ℃过夜。第2天用HRP标记的山羊抗兔二抗孵育，二氨基苯孵育显色，苏木素复染脱水透明，中性树胶封片。

1.5 U87细胞培养 胶质瘤细胞系(U87)使用DMEM培养基，辅助1% L-谷氨酰胺和10%胎牛血清(FBS)，在37 ℃，5% CO2进行培养。细胞传代时，用0.25%胰蛋白酶进行消化，每4～7天传代一次。

1.6CALU-siRNA构建与筛选 靶向人CALU的加载绿色荧光蛋白的siRNA序列由吉玛公司设计并合成，包括三个候选siRNA序列及一个对照siRNA序列。CALU-siRNA-1：5’-GCGCUGGAUUUACGAGGAU-3’，anti-sense 5’-AUCCUCGUAAAUCCA GCGC-3’；CALU-siRNA-2 sense:5’-GCUCAAAGACUGGAUUAAA-3’，anti-sense 5’-UUUAAUCCAGUCUUUGAGC -3’；CALU-siRNA-3 sense 5’- GCAUGACCU CAAUGAGGAC-3’，anti-sense 5’-GUCCUCAUUGAGGUCAUGC-3’。对照序列CALU-scramble sense:5’-GCGUAGGCAUUGAGUCGAU-3’，anti-sense 5’-AUCG ACUCAAUGCCUACGC-3’。

将U87细胞以5×104个/mL种植在培养皿，按照所需浓度将lipofectamine 2 000分别与100 pmol siRNA进行相应配制，室温下静置30 min后加入每个培养皿中，24 h后通过观察绿色荧光细胞数量占视野内光镜细胞比率直接计算转染效率，每孔均能达到>80%。

转染后的U87细胞内加入1 mL TRIzol，按照方法1.3提取总RNA，后进行RT-qPCR检测，以β-actin为内参，计算CALU的mRNA相对表达量。转染后的U87细胞用PBS漂洗后加入蛋白裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂，充分震荡，将裂解细胞收集至1.5 mL离心管，在4 ℃下12,000 g离心后取上清液。将制备好的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入CALU抗体(1∶500稀释)，以β-actin作为内参对照，4 ℃下过夜。TBST充分洗膜，羊抗兔二抗(1∶5 000稀释)室温孵育2 h，TBST充分洗膜，滴入化学发光剂ECL，图像分析系统采集分析Calumenin蛋白表达量。组间比较CALUmRNA和蛋白表达进行siRNA序列筛选，确定沉默最佳的siRNA序列。

1.7 转染CALUsiRNA后U87细胞增殖和Transwell侵袭实验 细胞增殖用MTT试剂盒检测，取上述转染CALUsiRNA沉默最佳序列和对照序列的U87细胞(各5×104个/mL)分别接种到96孔板，10%FBS的DMEM培养基100 uL。培养24 h、48 h和72后分别加入50 μL 1倍稀释的MTT液，在37 ℃孵育4 h，吸出上清液，每孔加150 μL DMSO使甲月赞溶解，用平板摇床摇匀。用酶标仪在570 nm波长处检测每孔的光密度。所有实验均重复3次。

取转染CALU-siRNA沉默最佳序列与对照序列的U87细胞悬液各2 mL(5×104个/mL)分别加入Transwell小室，下室加1 mL DMEM培养基，37 ℃孵育24 h。后取出下室基底膜，擦去上室内细胞，PBS漂洗，甲醇固定30 min，苏木素溶液行细胞核染色。迁移的细胞数量在200倍显微镜下观察，每组3个复孔，每孔随机观察5个视野。计算细胞侵袭率(%)=穿膜细胞数/上室接种的细胞总数×100%。以对照组迁移率设定为100%，计算实验组相对于对照组的迁移率。

2 结果

2.1CALU在人脑组织中的表达 如图1B所示，CALU在正常脑组织中并无表达，而在手术切除的人脑胶质母细胞瘤组织标本中，免疫组化染色显示有阳性表达(图1C)。通过RT- qPCR检测两组不同组织中CALUmRNA，结果显示CALU在胶质瘤中的mRNA表达是其在正常组织中的(4.971 ± 0.5012)倍(P<0.001)。

A：CALU mRNA在胶质母细胞瘤中表达是正常组织的4.97倍(P<0.001)；B：成人正常脑组织CALU免疫组化染色；C：成人脑胶质母细胞瘤组织CALU免疫组化染色。图1 CALU在成人正常脑组织与胶质母细胞瘤组织中的表达(×40)

2.2CALU-siRNA序列的筛选 为进一步研究CALU在胶质瘤中的作用，本课题设计了能够沉默CALU表达的siRNA序列。经过筛选，如图2所示，相对于对照序列，CALU-siRNA-2序列可将CALUmRNA降低75%以上，Western blot也证实CALUsiRNA-2序列能够显著降低U87细胞中的CALU蛋白表达，因此，本课题选择CALU-siRNA-2序列进行后续实验。

A：CALU-siRNA序列转染U87细胞后CALU mRNA水平，B：CALU-siRNA序列转染U87细胞后CALU蛋白表达；1：空白对照；2.Scramble siRNA；3.CALU-siRNA-1；4.CALU -siRNA-2；5.CALU-siRNA-3。图2 CALU-siRNA序列筛选

2.3CALU-siRNA转染U87细胞后增殖显著下降 将U87细胞种植于96孔培养板中，转染最佳CALU-siRNA序列后每24小时测量细胞增殖率变化情况。如图3所示，在转染后24 h，沉默组的增殖比率已显著小于对照组，这个现象在转染后的72 h差异达到58%(P<0.001)。

2.4CALU-siRNA转染U87细胞后迁移能力显著下降 通过transwel检测CALU-siRNA转染后对U87细胞迁移的影响(见图4)。转染后24 h可见CALU-siRNA组的迁移能力显著小于对照组，约为后者的38.5%(P<0.001)。

*P<0.01， #P<0.001。图3 沉默CALU后U87细胞增殖情况

A:对照组;B:CALU-siRNA组;C:沉默CALU后U87细胞迁移能力， *P<0.001。图4 沉默CALU后U87细胞迁移情况(×40)

3 讨论

胶质母细胞瘤是中枢神经系统中一种恶性肿瘤，其生存期短、致残率高的特点一直困扰着医学临床与科研者。通过大规模基因组学测序，与胶质母细胞瘤恶性程度相关的基因被不断发现，对这种恶性肿瘤发生机制的认识不断更新与阐明。基于前期预实验，我们通过本研究结果发现CALU在成人胶质母细胞瘤组织中有高表达，并且在U87胶质瘤细胞系中的分析显示其可能直接参与到肿瘤恶性程度的机制中。

CALU是位于哺乳动物体内的一种低亲和力钙结合蛋白。在心脏、胎盘和骨骼肌中表达量最高，其次是在肺、肾和胃，而在大脑和肝脏中表达最少[8]。在Vasiljavic的研究中，CALU在胚胎小鼠的大脑中的表达量可与其富含的心脏相比，但此表达量随着小鼠发育的成熟却逐渐下降，到成年时最低，通过Western blot方法几乎测不出来[6]。进一步的研究发现，中枢神经系统中CALU在脑室周围的表达量最高，此区域一直被认为是神经干细胞的发源地[9]。在胚胎期的小鼠脑齿状回中，阳性表达CALU的细胞集中于NeuN阴性、GFAP阳性细胞中，证实CALU主要还是在胶质细胞中表达。值得注意的是，生理情况下CALU可以被分泌至外周血中，通过自分泌与旁分泌方式对细胞骨架起调控作用[10]，但在神经系统中其作用机制仍在研究中。本研究在正常人脑组织中没有检测到CALU的表达，与前述动物研究结果一致，但在人脑胶质母细胞瘤组织证实了CALU的阳性表达。Sreekanthreddy等[11]曾提示胶质母细胞瘤患者血清中CALU的表达量明显升高，并且与预后直接呈正相关性，这与本研究结果在一定程度上具有关联性。本研究通过免疫组化染色发现CALU在成人正常脑组织中无表达，而在胶质母细胞瘤中却呈阳性表达，故而推测CALU的表达升高在胶质母细胞瘤的发生发展中起到关键作用，同时可能对患者预后有一定影响，但这个假设需要临床随访记录进一步的验证。

通过RT-qPCR检测方法我们发现CALU在人脑胶质母细胞瘤中mRNA表达量是其正常脑组织的近5倍。有意思的是，通过文献回顾我们发现，CALU在不同类型肿瘤中的表达也存在差异性，如在头颈部的鳞状细胞癌[12]、子宫内膜癌[13]、肝细胞癌和胰腺癌[14]中其表达呈递减趋势，而在结肠癌中却呈高表达状态[15]。我们推测这种差异可能与CALU在不同肿瘤组织中的作用不同有关。另外，已有研究发现CALU具有15个不同的mRNA剪切体[16]，其在不同肿瘤组织中的差异性表达也许还与不同的剪切体变化量有关。为研究CALU缺失可能对肿瘤细胞增殖与迁移的影响，我们设计CALU-siRNA序列并转染U87细胞，检测其对U87细胞增殖和迁移的作用，为下一步治疗靶点选择实验打下基础。同时，本实验也直接证实了U87胶质瘤细胞系中确实有CALU基因表达。

作为肿瘤的两大特征，增殖与迁移能力在各项肿瘤研究中被广泛评估。通过沉默CALU表达后发现，U87细胞的增殖与迁移能力均显著降低，这一结果提示CALU可直接影响胶质瘤细胞的恶性程度，但是其机制目前不清。有研究提示在肝细胞癌中CALU与Fabulin-1协同作用于细胞迁移[14]；另外的研究结果也提示CALU在内质网表达并影响细胞迁移，在心肌肌浆网中，CALU可通过SERCA2来调节钙离子内流，进而可能影响细胞增殖[17]。但考虑到不同肿瘤组织CALU的表达量也不同，有可能其机制不能通过前述研究来解释。尤其是胶质母细胞瘤为不均一肿瘤，其瘤内异质性极大，所以CALU的作用也有可能不尽相同，这些都需要进一步的后续研究进行阐明。

综上所述，本研究发现CALU在成人脑胶质母细胞瘤中高表达，且细胞生物学研究显示其对肿瘤细胞增殖及迁移产生影响，随着对CALU的研究深入，可能为将来的基因治疗或生物药物研发提供了一个潜在靶点。

[1] Ostrom Q T,Gittleman P H,Farah A O,et al.CBTRUS statistical report:Primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006-2010[J].Neuro Oncol,2013,15( Suppl 2):1-56.

[2] Rousseau A,Mokhtari K,Duyckaerts C.The 2007 WHO classification of tumors of the central nervous system - what has changed? [J].Current Opinion in Neurology,2008,21(6):720-727.

[3] Stupp R,Mason W P,Van den Bent M J,et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J].N Engl J Med,2005,352(10):987-996.

[4] Sahoo S K,Kim D H.Characterization of calumenin in mouse heart[J].BMB Rep,2010,43(3): 158-163.

[5] Honore B.The rapidly expanding CREC protein family:members,localization,function,and role in disease[J].Bioessays,2009,31(3):262-277.

[6] Vasiljevic M,Heisler F F,Hausrat T J,et al.Spatio-temporal expression analysis of the calcium- binding protein calumenin in the rodent brain[J].Neuroscience,2012,202:29-41.

[7] 仇文颖,刘帆,杨倩,等.人脑组织库样本100例质量及影响因素分析[J].解剖学报,2016,47 (3):6.

[8] Vorum H,Liu X,Madsen P,et al.Molecular cloning of a cDNA encoding human calumenin,expression in Escherichia coli and analysis of its Ca2+-binding activity[J].Biochim Biophys Acta,1998,1386(1):121-131.

[9] Xie Q,Flavahan W A,Bao S,et al.The tailless root of glioma:cancer stem cells[J].Cell Stem Cell,2014,15(2):114-116.

[10] Ostergaard M,Hansen G A,Vorum H,et al.Proteomic profiling of fibroblasts reveals a modulating effect of extracellular calumenin on the organization of the actin cytoskeleton[J].Proteomics,2006,6(12):3509-3519.

[11] Sreekanthreddy P,Srinivasan H,Kumar D M,et al.Identification of potential serum biomarkers of glioblastoma:serum osteopontin levels correlate with poor prognosis[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2010,19(6):1409-1422.

[12] Wu W,Tang X,Hu W,et al.Identification and validation of metastasis-associated proteins in head and neck cancer cell lines by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry[J].Clin Exp Metastasis,2002,19(4):319-326.

[13] Voisin S N,Krakovska O,Matta A,et al.Identification of novel molecular targets for endometrial cancer using a drill-down LC-MS/MS approach with iTRAQ[J].Plos One,2011,6(1):e16352.

[14] Wang Q,Shen B,Chen L,et al.Extracellular calumenin suppresses ERK1/2 signaling and cell migration by protecting fibulin-1 from MMP-13-mediated proteolysis[J].Oncogene,2015,34(8):1006-1018.

[15] Mikula M,Rubel T,Karczmarski J,et al.Integrating proteomic and transcriptomic high-throughput surveys for search of new biomarkers of colon tumors[J].Funct Integr Genomics,2011,11(2):215-224.

[16] Feng H,Chen L,Wang Q,et al.Calumenin-15 facilitates filopodia formation by promoting TGF-beta superfamily cytokine GDF-15 transcription[J].Cell Death Dis,2013,4:e870.

[17] Sahoo S K.Characterization of calumenin-SERCA2 interaction in mouse cardiac sarcoplasmic reticulum[J].J Biol Chem,2009,284(45):31109-31121.

[收稿2017-04-15;修回2017-05-10]

(编辑：王福军)

Expression ofCalumeninin human glioblastoma and functional study in cellular activities in U87 cells

KangPeng1,2，ZhangPeng1,2，WangYu1,2

(1.Department of Neurosurgery,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University， Beijing 100050 ，China; 2.China National Clinical Research Center for Neurological Diseases，Beijing 100050，China)

Objective To examine the expression of Calumenin in adult human glioblastoma tissues and further investigate the cytobiological function in U87 cellsinvitro.Methods Human tissues were collected from surgically resected glioblastoma (tumor group) located or non brain diseases (control group).Quantitative real-time PCR and immunohistochemical staining were carried out to detect the expression of Calumenin in human glioblastoma (GBM) samples resected from adult frontal lobe.The phenotypic changes of U87 cells like proliferation and migration were investigated in the absence of Calumenin mediated by RNAi.Results The results showed that Calumenin mRNA level in human GBM was significantly higher by approximately 5 fold (P<0.001) than normal brain post-mortem tissue samples.The protein level was verified by immunohistochemistry in GBM tissues.After Calumenin was knocked down by RNAi,U87 MG cells manifested a significant decrease in proliferation and migration ratesinvitro.Conclusion Our data indicated that Calumenin was involved in the regulation of glioblastomainvitroand it may serve as an important potential therapeutic target for treatment.

Calumenin; glioblastoma; U87; proliferation; migration

北京市优秀人才培养资助(青年骨干)项目(NO:2015000021469G221)。

王宇，男，博士，研究方向：大脑胶质瘤的临床治疗与分子生物学机制， E-mail:zlzxwy@sina.com。

R739.41

A

1000-2715(2017)03-0292-05