砷的不同形态在石菖蒲中的分布

陈 练 马莎莎 - 易伦朝 - 颜鸿飞 - 王利兵 - 黎继烈 -

(1. 湖南出入境检验检疫局，湖南 长沙 410004；2. 中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004；3. 昆明理工大学云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500)

砷的不同形态在石菖蒲中的分布

陈 练1,2CHENLian1,2马莎莎3MASha-sha3易伦朝3YILun-zhao3颜鸿飞1YANHong-fei1王利兵1,2WANGLi-bing1,2黎继烈2LIJi-lie2

(1. 湖南出入境检验检疫局，湖南 长沙 410004；2. 中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004；3. 昆明理工大学云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500)

建立砷元素6种形态的分析方法，研究砷的不同形态在石菖蒲不同部位中的含量、分布及转化。采用高效液相色谱法(HPLC)分离，色谱柱HAMILTON PR-X100阴离子交换柱(4.1 mm×250 mm，10 μm)；流动相A为水，流动相B为pH 8.5的碳酸铵(50 mmol/L)与甲醇(1%)混合液，梯度洗脱，电感耦合等离子体原子发射光谱质谱联用仪(ICP-MS)测定不同形态的砷。该方法线性范围为0.995～0.999，回收率为89%～97%。建立的检测方法准确、稳定、可靠。对石菖蒲根茎、叶及与外源性三价砷浸泡后的根茎、叶进行检测发现，石菖蒲样品中只存在砷的无机形态，且三价砷为主要存在的无机形态。石菖蒲的根茎为无机砷的主要富集部位，石菖蒲的根茎、叶均能将部分高毒性的三价砷转化为毒性较低的五价砷。

砷；形态分析；石菖蒲；HPLC-ICP-MS

石菖蒲是一种天南星科、菖蒲属禾草状多年生草本植物，具有镇静安神、理气活血、豁痰开窍等功效[1-3]。民间常食用石菖蒲以助益智安神。然而，有文献[4]报道，石菖蒲中元素砷的含量较高。砷的毒性与其存在的形态密切相关[5-7]。在砷的几种存在形态中，三价砷(As III)的毒性最大，五价砷(As V)的毒性次之；一甲基砷(MMA)、二甲基砷 (DMA)的毒性较小；砷甜菜碱(AsB)和砷胆碱(AsC)几乎没有毒性。因此，要客观地对元素砷进行评价，仅考察砷的总量是不够的，需要进一步了解砷的各种形态的分布和含量。

目前，石菖蒲的研究文献[8-9]主要涉及有机物和元素总量，而对砷形态分析的文献[10-12]多侧重于形态砷的含量分析，鲜见砷的不同形态的分布和迁移转化研究。石菖蒲中砷的形态分析尚未见报道，不同形态的砷在石菖蒲不同部位分布和转化的文献也未见报道。本研究采用高效液相色谱-电感耦合等离子体原子发射光谱质谱联用技术(HPLC-ICP-MS)建立砷的6种形态的分析方法，研究砷的不同形态在石菖蒲不同部位的含量、分布及转化。为砷的不同形态在石菖蒲中以至于植物产品中的分布、转化研究，以及植物产品对砷的减毒作用研究，提供有价值的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准物质亚砷酸根[三价砷，标准物质编号GBW08666，批号 1503，摩尔浓度(1.011±0.016) μmol/g]、砷酸根[五价砷，标准物质编号GBW08667，批号1503，摩尔浓度(0.233±0.005) μmol/g]、一甲基砷[标准物质编号GBW08668，批号 1412，摩尔浓度(0.335±0.011) μmol/g]、二甲基砷[标准物质编号GBW08669，批号1412，摩尔浓度(0.706 0±0.002 4) μmol/g]、砷甜菜碱[标准物质编号GBW08670，批号1412，摩尔浓度(0.518±0.015) μmol/g]、砷胆碱[标准物质编号GBW08671，批号1305，摩尔浓度(0.374±0.015) μmol/g]：中国计量科学研究院；

标准物质黄芪：标准物质编号GBW 10028[GSB-18，总砷含量(0.57±0.05) μg/g]，中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所；

砷标准溶液：标准物质编号GSB G 62028-90，批号13011627，浓度1 000 μg/mL，国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院；

锗标准溶液：标准物质编号GSB04-1728-2004，批号14307-3，浓度1 000 μg/mL，国家有色金属及电子材料分析测试中心；

碳酸铵、硝酸(65%)、氨水(25%)：优级纯，德国Merck公司；

甲醇：色谱纯，德国Merck公司；

石菖蒲样品：湖南长沙，经中南大学湘雅医学院刘韶教授鉴定为石菖蒲(Acorustatarinowii)的根茎叶。

1.2 试验仪器

高效液相色谱仪：1200型，配色谱柱HAMILTON PR-X100阴离子交换柱(4.1 mm×250 mm，10 μm)，美国Agilent公司；

电感耦合等离子体发射光谱质谱联用仪：820-MS型，配碰撞反应器，美国Varian公司；

超声波仪：B8510E-MT型，频率60 HZ，美国Branson公司；

离心机：Universal 320型，德国Heittich公司；

旋转蒸发仪：LABOROTA 4000型，德国Heidolph公司；

恒温水浴摇床：BT300型，日本Yamato公司；

分析天平：MS403S型，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 检测方法

1.3.1 仪器条件 ICP-MS仪器条件见表1。ICP-MS测定75As，开启碰撞模式以消除可能存在的多原子离子35Cl40Ar的干扰。采用内标元素72Ge补偿信号漂移。

液相色谱条件：色谱柱为HAMILTON PR-X100阴离子交换柱(4.1 mm×250 mm，10 μm)。流动相A为水，B为pH 8.5的碳酸铵(50 mmol/L)与甲醇(1%)混合液。洗脱程序：0.0～3.0 min，100% B；3.1～9.0 min，90% B；9.1～9.5 min，100% B。流速1 mL/min；进样体积20 μL。

表1 ICP-MS 仪器参数表Table 1 Instrument parameters of ICP-MS

1.3.2 溶液的配制

(1) 标准工作溶液的配制：三价砷、五价砷、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜碱、砷胆碱标准溶液用超纯水逐级稀释为混合标准工作液，浓度见表2。6种形态砷标准工作液中保持内标物质锗的浓度为5 ng/mL。

表2 工作溶液浓度表Table 2 Concentrations of standard solutions nmol/mL

(2) 外源性三价砷接触溶液的配制：三价砷标准溶液用超纯水稀释成50 mL浓度分别为5.06，10.11，50.55，101.10 nmoL/mL 的三价砷浸泡液。

(3) 流动相B的配制：50 mmol 碳酸铵溶解于近1 L甲醇溶液(1%)中，用硝酸和氨水溶液调节pH 值为8.5，再用甲醇溶液(1%)定容至1 L，混匀、脱气备用。

1.3.3 供试品溶液的制备

(1) 石菖蒲样品供试溶液的制备：将石菖蒲的根茎和叶完全剥离，称取4 g根茎或叶分别置于陶瓷研钵中研磨。用约20 mL 提取液少量多次冲洗研钵与研杆后，溶液及样品全转移至100 mL三角烧瓶中。60 ℃恒温水浴振荡提取2.5 h后，浸提液4 500 r/min离心5 min，取清液过滤。样品残渣再次用20 mL提取液按上述过程提取两次。过滤清液置于250 mL圆底蒸馏瓶中旋转蒸馏浓缩后用超纯水转移定容到10 mL容量瓶。该溶液中保持内标物质锗的浓度为5 ng/mL。

(2) 外源性三价砷接触样品供试溶液的制备：称取4 g根茎或叶样品分别于三价砷接触溶液中浸泡一定的时间。取出晾干后，与石菖蒲样品相同的方法处理。

(3) 标准物质样品供试溶液的制备：称取1 g黄芪标准物质与样品同样处理。

2 结果与讨论

2.1 方法的有效性

6种砷的形态在以上色谱条件下，分离良好，见图1。采用逐步稀释测定3倍信噪比的方法，获得6种砷形态的检出限。对同一浓度的标准溶液重复进样6次，计算出峰时间的相对标准偏差，考察重现性。在0～20 nmol/mL浓度范围内，对6种形态砷的色谱峰与浓度进行拟合。回归方程、相关系数、相对标准偏差及检出限数据见表3。由表3可知，6种形态砷的色谱峰与浓度间相关系数在0.995以上，有良好的线性关系。相对标准偏差小于5%，方法有良好的精密度。As(III)、As(V)的检出限可达0.05 nmol/mL，MMA、DMA、AsB、AsC的检出限可达0.03 nmol/mL，方法具有良好的灵敏度。

方法的准确性用黄芪标准物质及样品加标回收进行验证。黄芪标准物质中砷的标识值为(0.57±0.05) μg/g，用该方法进行测定，只检出三价砷和五价砷，含量分别为0.10 μg/g及0.45 μg/g，总砷含量为0.55 μg/g，与标准物质的标示值相符。实际样品添加回收为89%～97%，数据见表4。由黄芪标准物质测定值和回收率数据可知，方法具有良好的准确性。

表3 回归方程、相关系数、相对标准偏差及检出限Table 3 Regression equation, correlation coefficient, relative standard deviation and detection limit of the method

表4 添加浓度及回收率Table 4 Added concentrations and recoveries

2.2 无机砷在石菖蒲不同部位的分布及迁移试验

用建立的方法对石菖蒲样品进行检测，根茎中三价砷的含量为2.22 μmoL/kg，五价砷含量为0.3 μmoL/kg，一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜碱及砷胆碱均为未检出；石菖蒲的叶中各种形态的砷均为未检出。

三价砷为各种砷形态中毒性最大的，也是石菖蒲中砷的主要存在形态，因此，选择砷的三价形态，研究其在石菖蒲不同部位中的迁移规律。考察在不同外源性三价砷接触浓度和不同接触时间的影响下，石菖蒲根茎和叶对无机砷吸收积累的量。扣除其本身的三价砷、五价砷的量，石菖蒲根茎和叶对无机砷吸收积累的量结果见表5、6。

2.3 讨论

由表5、6可知，在高毒性三价砷单一来源接触的情况下，石菖蒲样品的根茎和叶均富集了三价砷和五价砷。可见，石菖蒲的根茎和叶均能通过生物代谢，将部分高毒性的三价砷转化为较低毒性的五价砷。这可能是在石菖蒲根茎、叶细胞中，部分三价砷可以作为电子供体，被As(III)氧化酶催化从而被氧化为五价砷[13-14]，达到部分降低无机砷毒性的效果。

表5 不同浓度三价砷浸泡液浸泡4 d时石菖蒲根茎、叶中无机砷的分布量Table 5 Distribution of inorganic arsenic in rhizomes and leaves of Acori Tatarinowii Rhizoma soaked in different concentrations of As (III) solutions for 4 days

表6 10.11 nmol/mL三价砷浸泡液浸泡不同时间石菖蒲根茎、叶中无机砷的分布量Table 6 Distribution of inorganic arsenic in rhizomes and leaves of Acori Tatarinowii Rhizoma soaked in 10.11 nmol/mL As (III) solutions for different times

图1 6种砷形态的色谱图Figure 1 Chromatogram of six arsenic speciations

在根茎和叶中，三价砷、五价砷的积累量均与外源性三价砷的浓度及接触时间成正比。随着浓度和时间的增加，三价砷积累量的增幅高于五价砷积累量的增幅。可见，在三价砷单一来源接触的情况下，三价砷仍是石菖蒲根茎和叶对砷的主要富集形态。

石菖蒲的根茎及叶对无机砷总量的积累与外源性高毒性的三价砷的浓度及接触时间呈正相关。且在两个因素下，石菖蒲的根茎对无机砷的积累总量均高于叶。可见，石菖蒲的根茎是积累无机砷的主要部位。这可能是在石菖蒲的根茎部无机砷与巯基化合物络合，生成较为稳定的砷-巯基络合物，影响了无机砷向叶部的迁移，使得无机砷大部分富集在石菖蒲的根茎部[13-14]。

3 结论

本试验建立的6种形态砷的分析方法灵敏、稳定、可靠。运用该方法测定石菖蒲中砷的形态，发现石菖蒲中只存在无机形态的砷，其中三价砷为主要的存在形态。在有外源性三价砷接触的情况下，石菖蒲样品也只表现出对无机形态砷的积累。根茎是无机形态砷积累的主要部位。石菖蒲根茎和叶均能将部分三价砷转化为五价砷，但三价砷仍为积累的主要形态。石菖蒲对外源性无机形态砷的积累与接触时间和浓度呈正比。本试验的研究成果对砷的不同形态在石菖蒲中的分布、转换研究有重要的参考价值；可为砷的不同形态在植物产品中的分布、转化及植物产品对砷的减毒作用研究提供了参考数据。

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Distribution Research of Arsenic speciationinAcoriTatarinowii

(1.HunanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Changsha,Hunan410004,China; 2.KeyLaboratoryofCultivationandProtectionNon-woodForestTrees,MinistryEducation,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China; 3.YunnanFoodSafetyResearchInstitute,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming,Yunnan650500,China)

The speciation analytical method was developed to detect the arsenic (As) and research its styles, contents and distribution inAcoritatarinowii. The arsenic speciation was separated by high performance liquid chromatograph with anion exchange column (HAMILTON PR-X100, 4.1 mm×250 mm，10 μm). Mobile phases were ultra-pure water (A) and 50 mmol/L ammonium carbonate with 1% methanol(pH 8.5, B). Inductively coupled plasma emission and mass spectrometry was involved to detect arsenic speciation. The linear ranges were between 0.995 and 0.999, and the rate of recovery ranged from 89% to 97%. The method was confirmed to be accurate, stable and reliable. The results showed that leaves soaked in different contents As (III) solution for different times, only inorganic speciation of As was found, among which As (III) was the main speciation. The rhizome ofA.tatarinowiiwas the main enrichment position absorbing the inorganic arsenic. Both the rhizome and the leaves could transform the As (III) to As (V).

arsenic; speciation research;Acoritatarinowii; HPLC-ICP-MS

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.005

湖北省科技支撑计划项目(编号：2015BHE015)；湖北省自然科学基金(编号：2014CFB891)；国家国际科技合作与交流项目(编号：2014DFG32310)

杨宁，男，武汉轻工大学助理实验师，硕士。

何静仁(1974—)，男，武汉轻工大学教授，博士。 E-mail：jingren.he@whpu.edu.cn

2017-02-08