热处理对脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用

邹忠义，黄斐，孙建利，冯志，石瑞婷，李洪军

（1.公安海警学院后勤管理系，浙江宁波315801；2.西南大学食品科学学院，重庆400716）

热处理对脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用

邹忠义1，黄斐1，孙建利1，冯志1，石瑞婷1，李洪军2，*

（1.公安海警学院后勤管理系，浙江宁波315801；2.西南大学食品科学学院，重庆400716）

研究热处理对脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和T-2毒素的去除作用。测试不同温度、不同加热时间、不同pH值条件下热处理对DON和T-2毒素影响，采用高效液相色谱-质谱测定毒素及其衍生物，采用外标法定量。DON在中酸性条件下，121℃加热60 min，DON浓度保持稳定，碱性条件能促进DON的热降解。T-2毒素在中酸性条件下，105℃加热30 min开始降解，121℃处理pH值为7的1.0 μg/mL T-2毒素溶液60min，T-2毒素去除率分别为（51.98±3.37）%，碱性条件能促进T-2毒素的热降解。在一定条件下，热处理对DON、T-2毒素具去除作用。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）；T-2毒素；热处理；去除

单端孢霉烯族毒素（trichothecenes）是由镰刀菌等产生的一类真菌毒素[1]，它包含多种毒素，其中最具有代表性是脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和T-2毒素[2-3]，对人和动物具有多种毒性[4-5]。它们广泛存在于各种环境中[6]，目前还没有完全有效的适宜去除方法，给粮食和饲料产业带来大量经济损失，也给食品安全带来一定隐患，所以必须采取有效的措施来控制这类毒素的污染[7]。

大多数真菌毒素在常规食品加工温度范围内对热具有抵抗力，在通常烹饪条件下，例如常压蒸煮、巴氏灭菌，真菌毒素含量降低很少或不降低[8]。Ryu等[9]、Bullerman等[10]对这方面研究进行了综述，提到DON等毒素对热稳定，会一定程度上保留在加工后的产品中。本工作将研究热处理对单端孢霉烯族毒素去的除作用，探索去除此类毒素的方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DON、T-2 毒素、脱环氧 DON（deepoxy-deoxynivalenol，DOM-1）、DON-3-葡萄糖苷、15-乙酰-DON（15-acetyl-deoxynivalenol，15-A-DON）、3-乙酰-DON（3-acetyl-deoxynivalenol，3-A-DON）、T-2 四醇、T-2三醇、T-2四醇四乙酸酯、HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇（neosolaniol，NEO）（纯度均≥99%）、正己烷、乙腈、甲醇、乙酸铵、甲酸（均为色谱纯）、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要仪器

CPA225D电子天平：德国Sartorius公司；Finnpipette移液器：美国Thermo Scientific公司；XW-80A漩涡混合器：江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；S20P-K pH计：瑞士Mettler-Toledo公司；SW22恒温振荡器：德国JULABO公司；LABO AUTOCLANE MLS-3780高压灭菌锅：日本SANYO公司；SIGMA 3-30k离心机：美国Sigma-Aldrich公司；N-EVAPTM 116氮吹仪：美国Organomation Associates公司；Polytetrafluoroethylene滤膜（17 mm，0.22 μm）：丹麦 Frisenette公司。Sciex API 4000三重四级杆质谱仪（配有电喷雾离子源及Analyst software 1.5.1数据处理系统）：美国Applied Biosystems公司；UFLC LC-20AD高效液相色谱仪、Shim-peak UP-ODS分离柱（150 mm×4.6 mm，3.0 μm）、Shim-peak GPRC-ODS保护柱（8 mm×1.5 mm，5.0 μm）：日本Shimadzu公司。

1.3 主要方法

1.3.1 制备毒素标准储备液和工作液

制备毒素及其衍生物标准储备液：精确分别称取DON、T-2及其衍生物（DOM-1、15-A-DON、3-A-DON、DON-3-葡萄糖苷、T-2四醇、T-2三醇、T-2四醇四乙酸酯、HT-2、NEO）5.0 mg标准品于5 mL容量瓶中，用乙腈溶解成1.0 mg/mL标准储备液，避光-20℃条件下保存。

制备毒素及其衍生物标准工作液：分别用超纯水稀释、定容毒素及其衍生物标准储备液，制成0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μg/mL 的毒素、毒素衍生物及其混合物的标准工作液，避光4℃条件下保存。

制备不同pH值毒素溶液：先将超纯水调节pH值为 3、5、7、9（用 0.2 mol/L 盐酸溶液和 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液），分别取1 mL 100.0 μg/mL的DON、T-2毒素标准工作液加入到99 mL不同pH值水溶液中，制成1.0 μg/mL 不同 pH 值（3、5、7、9）的 DON、T-2 毒素工作液。

1.3.2 不同加热温度对DON和T-2毒素的影响

分别取10 mL 1.0 μg/mL pH 值为7的DON、T-2毒素工作液于25 mL具刻度玻璃试管（拧松管塞），在恒温振荡器和高压灭菌锅中，分别用80、90、100、105、110、115、121 ℃处理 30 min，处理完后，用超纯水定容至10 mL，以未处理毒素溶液为对照，用HPLC-MS/MS测定毒素及其衍生物。

1.3.3 不同加热时间对DON和T-2毒素的影响

分别取10 mL 1.0 μg/mL pH值为7的DON、T-2毒素工作液于25 mL具刻度玻璃试管（拧松管塞），在高压灭菌锅中，用 121 ℃分别处理 10、20、30、40、50、60 min，之后定容至10 mL，以未处理毒素溶液为对照，用HPLC-MS/MS测定毒素及其衍生物。

1.3.4 不同pH值时加热对DON和T-2毒素的影响

分别取 10mL 不同 pH 值（3、5、7、9）的 1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液于25mL具刻度玻璃试管（拧松管塞），在121℃高压灭菌锅中，分别加热60 min，之后定容至10 mL，以未处理毒素溶液为对照，用HPLCMS/MS测定毒素及其衍生物。

1.3.5 测定DON、T-2毒素及其衍生物

将待测溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤到HPLC进样瓶中，用HPLC-MS/MS分析。外标法定量。

1.3.6 色谱条件[7]

流动相：B（甲醇）；A（水，含 2mmol/L醋酸铵和0.1%甲酸）。梯度洗脱：0～5 min，5%B；5 min～6 min，5%～95%B；6 min～11 min，95%B。流速：0.3 mL/min。柱温：40℃。进样量：30 μL。

1.3.7 质谱条件[7]

扫描方式：正离子模式扫描；检测模式：多反应检测；气帘气压力：40 Pa（氮气）；离子源气体1：60 Pa（氮气）；离子源气体2：60 Pa（氮气）；离子源温度：650℃；界面加热器：ON；电喷雾电压：5 500.00 V；碰撞气压力：10 Pa（氮气）；其它条件如表1所示。

表1 DON、T-2毒素及其衍生物的跃迁监测及电喷雾离子源条件Table 1 Transitions monitored for DON，T-2 and their derivatives&ESI source conditions

表1 DON、T-2毒素及其衍生物的跃迁监测及电喷雾离子源条件Table 1 Transitions monitored for DON，T-2 and their derivatives&ESI source conditions

1.3.8 数据处理方法

数据处理采用Analyst software 1.5.1。用3次平均值±标准偏差（mean±SD）表示结果。采用PASW Statistics 18软件数据统计分析，显著性水平0.05，采用一维方差分析差异显著性分析，图上标不同大写字母表示数值差异显著（P＜0.05），相同大写字母表示数值差异不显著（P＞0.05）。

式中：R为毒素去除率，%；c0为处理前毒素浓度，μg/mL；c1为处理后毒素浓度，μg/mL。

2 结果与分析

2.1 不同温度热处理对DON和T-2毒素的影响

DON、T-2毒素浓度受加热温度的影响见图1。

由图1可知，pH值为7的1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液在80℃～121℃温度范围内，加热30 min，溶液中DON浓度保持稳定；在80℃～100℃温度范围内，加热30min，溶液中T-2毒素浓度保持稳定，在105℃～121℃温度范围内，加热30 min，溶液中T-2毒素浓度不断降低。与对照组（未加热处理）相比，105、110、115、121℃处理30min，T-2毒素去除率分别为（9.21±3.17）%、（10.89± 2.57）%、（12.28 ± 2.38）%、（15.94 ±2.18）%。

图1 DON、T-2毒素浓度受加热温度的影响Fig.1 Effect of heating temperature on concentrations of DON and T-2 toxin

2.2 不同加热时间对DON和T-2毒素的影响

DON、T-2毒素浓度受加热时间的影响见图2。

由图2可知，在121℃加热10 min～60 min，溶液中DON浓度保持稳定，溶液中T-2毒素浓度不断降低，与 0 min（未加热处理）相比，121 ℃处理 10、20、30、40、50、60 min，T-2毒素去除率分别为（5.94±3.17）%、（10.89±2.77）%、（15.94±2.08）%、（28.32±2.18）% 、（41.58±2.67）%、（51.98±3.37）%。

图2 DON、T-2毒素浓度受加热时间的影响Fig.2 Effect of heating time on concentrations of DON and T-2 toxin

2.3 不同pH值条件下热处理对DON和T-2毒素的影响

热处理中DON浓度受pH值的影响见图3。

图3 热处理中DON浓度受pH值的影响Fig.3 Effect of pH value of DON solution on DON concentration by heat treatment

由图3可知，pH值9的未加热处理对照溶液中DON浓度降为（0.935±0.026）μg/mL，DON去除率为（7.50±2.60）%；pH值（3、5、7）的未加热处理对照溶液中DON浓度保持稳定。pH值（3、5、7）的处理溶液（121℃处理60 min）中DON浓度保持稳定；pH值9的处理溶液（121℃处理60min）中DON浓度降为（0.755±0.031）μg/mL，DON 去除率为（25.50± 3.10）%，与 pH值为9的DON对照溶液相比，DON去除率增加了（18.00±0.50）%。

热处理中T-2毒素浓度受pH值的影响见图4。

由图4可知，pH值9的未加热处理对照溶液中T-2毒素浓度降为（0.95±0.035）μg/mL，T-2毒素去除率为（5.00±3.50）%；pH值（3、5、7）的未加热处理对照溶液中 T-2毒素浓度保持稳定。pH 值（3、5、7、9）的处理溶液（121℃处理60 min）中T-2毒素浓度分别降为 （0.485 ± 0.021）、（0.480 ± 0.023）、（0.475 ±0.022）、（0.317±0.031）μg/mL，T-2毒素去除率分别为（51.50±2.10）%、（52.00±2.30）%、（52.50±2.20）%、（68.30±3.10）%。其中pH值9的处理组（121℃处理60 min）与pH值为9的对照组（未加热处理）相比，T-2毒素去除率增加了（63.30±0.40）%。

图4 热处理中T-2毒素浓度受pH值的影响Fig.4 Effect of pH value of T-2 toxin solution on T-2 toxin concentration by heat treatment

2.4 分析热处理DON和T-2毒素

检测上述经过热处理DON、T-2毒素溶液，未发现毒素衍生物 DOM-1、15-A-DON、3-A-DON、DON-3-葡萄糖苷、T-2四醇、T-2三醇、T-2四醇四乙酸酯、HT-2、NEO，推测可能将其转化为其它未知产物。

在本研究中，DON在中酸性（pH值为3、5、7）条件下，121℃加热10 min～60 min，DON浓度保持稳定，在碱性（pH值为9）条件下，未加热处理，DON浓度降低，说明DON在碱性条件下不稳定，Young等[13]也曾说明过这一点。在本试验中，在碱性（pH值为9）条件下121℃加热60 min DON浓度降低，与中酸性（pH值为3、5、7）条件下121℃加热60 min DON浓度保持稳定相比，说明碱性条件能促进DON的热降解。目前关于DON的热稳定性研究，大多数集中在粮食及制品在热加工过程中对DON的影响。Numanoglu等[14]研究了面包加工工艺对对面包中DON含量的影响，发现面包焙烤工艺能降低DON含量。Pronyk等[15]研究了过热蒸汽对DON的去除作用，185℃过热蒸汽以0.35 m/s速度通过小麦6 min，能去除52%的DON，特别适合干物料中DON的去除，作用方式是热降解，而不是溶解和提取作用。Bretz等[16-17]研究了热处理对DON、NIV的影响，在碱性条件下，DON产生3种已知物质（norDON A、norDON B、norDON C）和 4 种未知物质（norDON D、norDON E、norDON F、9-羟甲基DON内酯），NIV产生了4种产物norNIV A、norNIV B、norNIVC、NIV 内酯，同时用永生人类肾脏上皮（IHKE）细胞进行细胞毒性试验，毒性试验结果表明，产物的细胞毒性要低于原形DON、NIV。

在本研究中，T-2毒素在碱性（pH值为9）条件下未加热处理，浓度降低，说明T-2毒素在碱性条件下不稳定，这和DON类似。T-2毒素中酸性（pH值为3、5、7）条件下 105℃～121℃加热 30 min～60 min，T-2 毒素浓度降低，说明T-2毒素在中酸性（pH值为3、5、7）条件下热稳定要低于DON。在碱性（pH值为9）条件下121℃加热60 min，T-2毒素的去除率要高于在中酸性（pH值为3、5、7）条件下121℃加热60 min的去除率，说明碱性条件能促进T-2毒素的热降解。目前关于T-2毒素的热稳定性研究报道不多，仅Beyer等[18]研究T-2毒素在加热条件下与α-D-葡萄糖的反应，发现生成3种产物，用永生人类肾脏上皮（IHKE）细胞做毒性试验，发现产物的细胞毒性要低于T-2毒素。

在本研究中，毒素类型、热处理温度、热处理时间、毒素溶液pH值对DON、T-2毒素热降解效果影响很大，这和Samaraeva等[19]、Rustom等[20]的研究结果类似，他们研究发现，在热降解AF中，AF的类型、加热温度和时间、热穿透力、水分含量、pH值、离子强度，在热降解中起着重要作用。

3 结论

研究结果表明在一定条件下热处理对DON、T-2毒素具去除作用，去除效果受到毒素类型、热处理温度、热处理时间、毒素溶液pH值的影响。因此，在一定条件下，可考虑将热处理方法作为去除该类毒素的一种措施。

[1] HE Jianwei,ZHOU Ting,YOUNG J C,et al.Chemical and biological transformations for detoxification of trichothecene mycotoxins in human and animal food chains:a review[J].Trends in Food Science&Technology,2010,21(2):67-76

[2] 邹忠义,贺稚非,李洪军,等.畜禽产品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素残留分析[J].食品科学,2013,34(14):208-211

[3] EFSA.Opinion of the scientific panel on contaminants in the food chain on a request from the commission related to deoxynivalenol(DON)as undesirable substance in animal feed (Question No EFSA-Q-2003-036)[J].The EFSA Journal,2004,73:1-42

[4] MORGAVI D P,RILEY R T.Fusarium and their toxins:mycology,occurrence,toxicity,control and economic impact[J].Animal Feed Science and Technology,2007,137(3/4):199-200

[5] PESTKA J J,SMOLINSKI A T.Deoxynivalenol:toxicology and potential effects on humans[J].Journal of Toxicology and Environmental Health,Part B,Critical Reviews,2005,8(1):39-69

[6]SHAPIRA R,PASTER N.Control of mycotoxins in storage and techniques for their decontamination.Mycotoxins in Food:Detection and Control[M].Abington:CRC Press,2004:190-223

[7] 邹忠义,黄斐,李洪军,等.紫外光辐照对脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用[J].食品科学,2015,36(19):7-11

[8]ZAKI M M,EL-MIDANY S A,SHAHEEN H M,et al.Mycotoxins in animals:Occurrence,effects,prevention and management[J].Journal of Toxicology and Environmental Health Sciences,2012,4(1):13-28

[9]RYU D,BIANCHINI A,BULLERMAN L B.Effects of processing on mycotoxins[J].Stewart Postharvest Review,2008,4(6):1-8

[10]BULLERMAN L B,BIANCHINI A.Stability of mycotoxins during food processing[J].International Journal of Food Microbiology,2007,119(1/2):140-146

[11]ZHOU Ting,HE Jianwei,GONG J.Microbial transformation of trichothecene mycotoxins[J].World Mycotoxin Journal,2008,1(1):23-30

[12]ZAKI M M,EL-MIDANY S A,SHAHEEN H M,et al.Mycotoxins in animals:occurrence,effects,prevention and management[J].Journal of Toxicology and Environmental Health Sciences,2012,4(1):13-28

[13]YOUNG J C,BLACKWELL B A,APSIMON J W.Alkaline degradation of themycotoxin 4-deoxynivalenol[J].Tetrahedron Letters,1986,27(9):1019-1022

[14]NUMANOGLU E,GÖKMEN V,UYGUN U,et al.Thermal degradation of deoxynivalenol during maize bread baking[J].Food Additives&Contaminants:Part A,2011,29(3):423-430

[15]PRONYK C,CENKOWSKI S,ABRAMSON D.Superheated steam reduction of deoxynivalenol in naturally contaminated wheat kernels[J].Food Control,2006,17(10):789-796

[16]BRETZ M,BEYER M,CRAMER B,et al.Thermal degradation of the Fusarium mycotoxin deoxynivalenol[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(17):6445-6451

[17]BRETZ M,KNECHT A,GÖCKLER S,et al.Structural elucidation and analysis of thermal degradation products of the Fusarium mycotoxin nivalenol[J].Molecular Nutrition&Food Research,2005,49(4):309-316

[18]BEYER M,FERSE I,MULAC D,et al.Structural elucidation of T-2 toxin thermal degradation products and investigations toward their occurrence in retail food[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(5):1867-1875

[19]SAMARAEVA U,SEN A C,COHEN M D,et al.Detoxification of aflatoxins in foods and feeds by physical and chemical methods[J].Journal of Food Protection,1990,53(6):489-501

[20]Rustom I Y S.Aflatoxin in food and feed:occurrence,legislation and inactivation by physical methods[J].Food Chemistry,1997,59(1):57-67

Removal of Deoxynivalenol and T-2 Toxin by Thermal Treatment

ZOU Zhong-yi1，HUANG Fei1，SUN Jian-li1，FENG Zhi1，SHI Rui-ting1，LI Hong-jun2，*
（1.Department of Logistics Management，China Maritime Police Academy，Ningbo 315801，Zhejiang，China；2.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China）

The effects of temperature，thermal time and pH value of toxin solutions on the removal of deoxynivalenol（DON）and T-2 toxin by thermal treatment were investigated.The concentration of toxins and their derivatives were analyzed by HPLC-MS/MS and quantified by external standard method.DON remained stable at 121℃for 60 min in neutral or acidic condition，but alkaline condition promoted thermal degradation of DON.T-2 toxin was degraded at 105℃ for 30 min in neutral or acidic condition，and removal rate of T-2 toxin was（51.98±3.37）%after 60 min of 121 ℃（pH value of toxin solution was 7，and concentration of toxin wase 1.0 μg/mL），and alkaline condition promoted thermal degradation of T-2 toxin.DON and T-2 toxin were removed by thermal treatment under certain conditions.

deoxynivalenol（DON）；T-2 toxin；thermal treatment；removal

2016-09-17

国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（2009CB118806）；宁波市自然科学基金项目（2014A610190）；公安海警学院科研发展基金项目（2013XYPYZ013）

邹忠义（1982—），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品科学与工程。

*通信作者

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.002