被子植物闭花授粉的研究进展

张代玉，骆 凯，吴 凡，王彦荣，张吉宇(草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020)

被子植物闭花授粉的研究进展

张代玉，骆 凯，吴 凡，王彦荣，张吉宇
(草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020)

闭花授粉(cleistogamy，CL)是一种完全自交的繁殖系统，属于最典型的自花授粉，近年来已经受到人们越来越多的关注。本文概述了闭花授粉的类型、花器官变异、在被子植物中的分布、系统进化和相关调控基因。闭花授粉分为兼性闭花授粉、完全闭花授粉和诱变闭花授粉3种类型，其中兼性闭花授粉所占的比例最大，约占总数的77.3%。基于这些分类，目前闭花授粉现象存在于53个科236个属705种被子植物中。与开花授粉(chasmogamy，CH)相比，CL花器官的数目相对减少，浆片退化。控制CL的基因有单基因、双基因和3对基因。无芒隐子草(Cleistogenessongorica)为典型的兼性闭花授粉植物，其CH和CL花存在明显的形态差异，种子具有异型性。通过对禾本科内植物进行系统进化分析发现，隐子草属(Cleistogenes)和双稃草属(Diplachne)的亲缘关系最近，同属于三齿稃亚族(Tridentinae)。这些信息为理解闭花授粉和其基因的生态学意义提供了宝贵的参考价值。

闭花授粉；开花授粉；系统进化；闭花授粉相关基因；被子植物

闭花授粉(cleistogamy，CL)由开花授粉(chasmogamy，CH)进化而来[1]，是花器官发育的一种变态。目前，在高粱(Sorghumbicolor)[2]、大麦(Hordeumvulgare)[3]、水稻(Oryzasativa)[4]等多种作物中均发现有CL现象。Darwin[5]对凤仙花属(Impatiens)、酢浆草属(Oxalis)及堇菜属(Viola)3个属的CL进行了描述，并认为CL是自然选择的结果。此后，CL的遗传基础、生理机制和进化对群体遗传结构的影响逐渐受到了植物学家和形态学家的关注[6-8]。目前CL的研究已经在50科228属693种中进行了报道[9]；尤其1970年以来，JSTOR全文库(http://www.jstor.org，Journal Storage)上发表的有关CL的文章数目明显增加(图1)。另外，CL能使植物避免受到外来花粉干扰而保持纯种，因此在不影响其农艺性状的前提下，培育具有闭花授粉特性的转基因新品种是抑制基因漂流、减少环境风险的一种理想策略[10]。鉴于闭花授粉机制逐渐受到广泛关注，为使人们进一步了解被子植物闭花授粉目前的研究现状、今后的发展趋势和应用前景，在前人对被子植物闭花授粉研究的基础上，搜集整理了此领域的最新成果，并结合闭花授粉在转基因作物上的重要性，简要总结了闭花授粉的分类、分布、系统进化及相关基因的研究进展。

图1 1910-2015年引用“闭花授粉”或“闭花授粉的”文章数目Fig. 1 Number of papers published from 1910-2015 that cite either “cleistogamy” or “cleistogamous”

1 闭花授粉的类型

闭花授粉是指在花朵未开放时成熟花粉粒在花粉囊内萌发，花粉管穿出花粉囊，伸向柱头，进入子房，把精子送入胚囊并完成授粉的过程。早在1906年，Hackel[11]对特有闭花授粉、两性闭花授粉和无性器官闭花授粉3种闭花授粉方式进行了区分。1981年，Lord[12]将Hackel对闭花授粉的分类方式归纳为“真”闭花授粉，并对所有闭花授粉方式进行了分类：1)花前闭花授粉，主要指花授粉发生在开花之前，这在栽培豆科、禾本科植物和其它农作物中普遍存在；2)假闭花授粉，开花期间花瓣不开放而完成的授粉；3)完全闭花授粉，仅产生CL花的授粉方式；4)“真”闭花授粉，CH花雄蕊和花冠减小形成CL花，这是由于同一品种或单株CH和CL花的不同起源所形成。由于Lord所观察的植物生长于非自然条件下，Darwin对这一分类方式提出了质疑。直到2007年，Culley和Klooster[9]根据CL发育过程又将闭花授粉分为3种类型：兼性闭花授粉(dimorphic cleistogamy，DC)、完全闭花授粉(complete cleistogamy，CC)和诱变闭花授粉(induced cleistogamy，IC)，这种分类方式已经被广泛认可并使用。

1.1 兼性闭花授粉

兼性闭花授粉类型和Lord[12]对闭花授粉分类中的“真”闭花授粉一致，CH和CL花的形态学差异源自它们不同的发育途径。与CH花相比，CL花的花冠和雄蕊长度较短或雄蕊数目较少。该类型的CH和CL两种花可在同一植株的不同位置同时存在，或者按照一定的时间顺序相继产生。CH和CL花的出现顺序取决于植物物种，草本植物毛竹(Violapubescens)的CH花仅在早春产生，CL花在其几周之后出现[8]；而其它植物种的CL花早于CH出现。CH花的出现是由早春特定的光周期和温度引起，例如二型花属植物Dichantheliumclandestinum是春季产生CL花，而在晚夏产生CH花[13]。笔者试验过程中在无芒隐子草(Cleistogenessongorica)中也发现，叶鞘内CL花早于CH花产生。

1.2 完全闭花授粉

完全闭花授粉的植株仅产生CL花，该授粉类型存在于多个植物物种。例如，日本科学家新发现的植物黑岛天麻(Gastrodiakuroshimensis)只产生CL花[14]；夏威夷地方性物种Schiedeatrinervis的花在授粉过程中一直处于闭合状态[15]。然而大部分CL植株的确定只是基于一部分单株在非自然条件下(例如温室)的观察。因此，确定一个植物种是否为完全闭花授粉，调查的对象必须包括自然环境中多个单株以确保无CH花的产生。

1.3 诱变闭花授粉

诱变闭花授粉是指CH花因环境阻碍未能开放，进而转变为CL花，这和Lord分类中的假闭花授粉相同。与兼性闭花授粉相比，该类型的CH和CL花并无形态学差异，而且CH花转变为CL花的速度较快。在此分类中，干旱和温度是促进CL花产生的主要因素。例如，一些东北极羊茅属(Festuca)的物种只有在低温和相对湿度较高的条件下才能由CH花转变CL花[16]。夏威夷马齿苋属(Portulaca)植物在光照和温度都降低的条件下，导致花未能张开，进而产生CL花[17]。也有研究表明，水稻经30 ℃高温连续处理4周后，其授粉类型可由CH转变为CL[18]。

2 闭花授粉的分布

闭花授粉广泛存在于被子植物中，据不完全统计，在被子植物的53科236属705种中均发现闭花授粉(表1)。统计结果还发现，有关闭花授粉的报道多集中在单子叶植物的禾本科(Poaceae)(326种)、兰科(Orchidaceae)(25种)和双子叶植物的堇菜科(Violaceae)(83种)、豆科(Fabaceae)(62种)及爵床科(Acanthaceae)(19种)中，这和Darwin的归类稍有差异，Darwin指出闭花授粉普遍存在于豆科、爵床科和金虎尾科(Malpighiaceae)中[5]。在属的水平上，有关闭花授粉的报道主要出现在针茅属(Stipa)(41种)、堇菜属(Viola)(80种)、二型花属(Dichanthelium)(19种)、扁芒草属(Danthonia)(17种)、裂稃草属(Schizachyrium)(17种)、喇叭茉莉属(Acleisanthes)(16种)、鼠茅属(Vulpia)(15种)、凌风草属(Briza)(14种)、车前属(Plantago)(13种)以及胡枝子属(Lespedeza)(13种)这10个属中。在所有的闭花授粉类型中，兼性闭花授粉所占的比例最大，约占总数的77.3%，这与Plitmann[53]得出的结论相似；完全闭花授粉(72种，10.4%)和诱变闭花授粉(81种，8.8%)分散于多个科和属种；仅有24种闭花授粉植物因缺少相关信息而尚未鉴定出闭花授粉类型。

CH和CL花数在不同植物单株、群体内和群体间所占的比例不同。一些植物单株上的CH/CL比值与植株的个体发育以及环境因素密切相关。Campbell等[19]对柔枝莠竹(Microstegiumvimineum)的CH/CL比值进行了统计分析，在阳光充足、种群竞争压力小的环境下，高大植株的CH/CL比值小于矮小植株；相反，光线不足且种群竞争压力大的森林中矮小植株的CH/CL比值达到最高。一些植物的CH/CL比值在种群内也会发生波动。Culley[8]在毛竹(Phyllostachysheterocyda)群体内发现，所有单株在第1年可同时产生CH和CL两种授粉类型，但是第2年CH和CL的分配会发生变化。其中74%的单株可同时产生CH和CL两种授粉类型，13%和9%的单株分别产生CH和CL花，剩余的4%仅进行营养生长。在凤仙花属植物Impatienspallida和I.biflora群体内对CL百分率(CL花数占总花的数目的比例)的调查发现，其CL百分率分别为69%～100%和80%～98%[21]。

3 闭花授粉花器官的变异

CL植物的花器官相对CH植物较小，数目也相对较少。CL的形成原因有一部分是由CH转变而来，另一部分是为了适应由浆片败育等原因引起的花闭合现象。

与CH植物的花相比，CL花中雄蕊、花药和花瓣的数目较少，浆片通常很小或者完全缺失。雄蕊退化是CL花的主要特征，利用扫描电镜观察两型豆(Amphicarpaeaedgeworthii)花的个体发育过程发现，CL花的雄蕊在发育过程中出现退化现象，仅1/5的花药可以正常发育并完成授粉[54]；在紫花地丁(Violaphilippica)中发现，经14 h光照诱变产生的CL花的花瓣缺失，并且花药由原来的5个减少为2个[55]。浆片吸水膨胀，将外稃向外推开，同时将内稃向内压挤，从而使外稃和内稃的钩合点松开并最终完成授粉，这是调控花开闭的关键因素[56]。CL和CH两种大麦栽培品种的比较研究发现，浆片于白色花药期开始表现出差异，绿色花药期差异达到最大，CL浆片厚度不及CH浆片一半[57]；笔者在无芒隐子草花形态学的观察中也发现，CH第1浆片和第2浆片的厚度分别为46.38和60.67 μm，是CL相同部位的1.58和2.25倍，而CL花的花药长度显著小于CH(P<0.01)。

4 闭花授粉的种子异型性

种子异型性(seed polymorphism)是指同一植株的不同部位产生不同形态或行为种子的现象。异型性种子之间往往在大小、产量等生物学特征以及休眠和萌发等生态行为上存在明显差异。大部分植物的异型性种子具有不同生态行为，这种特点在被子植物中普遍存在[58]。因此，种子异型性被认为是许多植物适应多样环境的重要策略，在生态进化方面具有重要的研究价值。

闭花授粉植株的种子具有异型性。如红毛菜(Triplasispurpure)通过CL产生的种子产量至少占总产量的72%，但CH的圆锥花序的种子产量最多占28%[59]；无芒隐子草叶鞘内CL小穗的种子产量占总产量的82%[60-61]；类似的现象在韩信草(Scutellariaindica)等闭花授粉物种中均有报道[62]。不同物种的CL和CH种子的休眠和萌发生态行为不同。如红毛菜顶穗CH种子萌发率明显高于CL叶鞘内种子萌发率，CL小穗中从下往上不同节种子仅在萌发时间上存在差异，其最终发芽率不随节间的变化而变化[63]。Imanishi等[64]在低温储藏处理对芡实(Euryaleferox)种子休眠的研究表明，CL种子小，在低温储藏90 d即可达到最大萌发率；而CH种子较大，需要180 d才能达到。无芒隐子草不同节间部位种子均存在休眠；经85 ℃处理后CL种子的的萌发率明显高于CH种子[65-66]。

5 禾本科闭花授粉植物的系统进化及其生态学意义

闭花授粉在禾本科中的分布最多，该科有88属326种中皆存在闭花授粉现象，因此从分子水平上研究和分析禾本科闭花授粉植物的系统进化，可为闭花授粉系统进化提供分子生物学依据。选取禾本科88个属植物，从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)获得rbcL和matK两个叶绿体基因序列，采用MEGA软件的ML分析(1 000次重复)进行系统进化分析(图2)。其中，鼠尾栗属(Sporobolus)、Tridens、三毛草属(Trisetum)、发草属(Deschampsia)、Thyridolepis、早熟禾属(Poa)、凌风草属(Briza)、Brachyachne、单花针茅属(Nassella)、Piptochaetium、针茅属(Stipa)11个属含有兼性闭花授粉和完全闭花授粉两种授粉类型(DC和CC)。而穗草属(Garnotia)、肠须草属(Enteropogon)、Tetrapogon、尖稃草属(Acrachne)、Habrochloa等仅产生完全闭花授粉类型(CC)。隐子草属(Cleistogenes)和双稃草属(Diplachne)亲缘关系最近，同属于三齿稃亚族(Tridentinae)。

CL是植物在长期进化过程中有效抵御不良环境的一种发育策略。CL可以扩大对干旱、高温等恶劣环境的适应性。Abdel-Ghani等[67]发现大麦在处于极度干旱时仍可继续完成授粉；Miranda等[68]的研究也表明，处于不同水分条件下的Ruelliasubsessilis在干旱季节进行CL，而CH发生在雨季。Koike等[18]对CL水稻高温处理4 h后发现，其可育比率高于CH植株，并认为CL植株的高可育性是由花颖片气孔的蒸腾作用而引起的。CL转基因新品种是减少环境风险的一种理想策略。无芒隐子草已被证实为一种极抗旱的荒漠旱生植物，可在年降水量为100 mm的地区生长，通过研究其抗旱生理生态和机理，利用克隆的抗旱基因显著改良了拟南芥(Arabidopsisthaliana)和紫花苜蓿(Medicagosativa)等植物的抗逆性[69-71]。

6 闭花授粉的相关基因

自1983年出现第1个转基因植物后，基因转化因其基因资源多样化、物种间基因流动的可能性等优点而深受人们关注，但转基因植物和野生种间的基因漂流可能危及生态平衡。近年来，闭花授粉被看作是一种阻止基因漂流的理想工具而备受关注[72]。至今，闭花授粉的遗传已被证实受单基因、双基因和3个基因控制。

单隐性控制的CL基因遗传方式已经在水稻[4]、木豆(Cajanuscajan)[73]、日本二棱大麦(H.vulgaressp.)[3]、硬粒小麦(Triticumturgidum)[74]中进行了报道。高粱[2]和大豆(Glycinemax)[75]的CL受双基因控制。受3个隐性基因控制的CL仅在小麦中进行了报道，该植物的CL基因在绿色花粉、黄色花粉和开花期的基因表达量达到最高[76]。大麦闭花授粉的表达受等位基因cly1和cly2控制，其中隐性基因cly1决定浆片能否吸水膨胀，显性基因cly2控制开花期能否提前，它们位于染色体2HL的同一位置[77]。

图2 禾本科闭花授粉植物系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of cleistogamous plants in Gramineae

注：含边框的表示同时含有DC和IC两种闭花授粉类型；黑色表示含DC闭花授粉类型；红色表示仅包括CC闭花授粉类型；绿色表示尚未确定；图中仅显示大于50%的自展支持率。

Note：Orders in boldfaced, italic fonts enclosed within frames contain both DC and IC flowers; black bars indicate the presence of DC flowers; red bars indicate only CC flowers, and green line indicate uncertain flowers; only the nodes receiving bootstrap or jackknife support above 50% are indicated.

目前普遍认为双子叶植物花器官发育的ABCDE模型也基本适用于单子叶植物。在水稻中，A类基因[78-79]包括RAP1A(rice apetalalgene A)、RAP1B(rice apetalalgene B)；B类基因[79-81]包括OsMADS2、OsMADS4和SPW1(superwoman1)；C类基因[82-84]包括RAG(rice agamous)和DL(drooping leaf)类；D类基因[83]包括OsMADS13；E类基因[85-86]包括LHS、OsMADS5、OsMADS7和OsMADS8。目前在水稻中已发现了4种CL突变体类型(表2)：d7(cleistoganous dwarf)、ld(t)(lodiculeless spikelet)、spw1-cls(superwoman1-cleistogamy)和cl7(t)[cleistogamy7(t)]。d7突变体浆片发育正常，内、外颖交界处部分融合，致使花药不外露，位于第7染色体长臂上。ld(t)突变体由于缺少浆片，致使开花期内外颖不能被正常推开，ld(t)已定位在第1染色体的末端。spw1-cls突变体是由于SPW1第45位氨基酸发生错义突变，致使浆片发生变形，形成浆片颖片嵌合体，导致内外颖不能打开。cl7(t)突变体花器官发育正常，内外颖并没有发生融合现象，由于细胞数量减少或者细胞变小引起株型、穗型、籽粒等性状的改变，位于第7染色体的RM21964和RM234之间。

表2 水稻不同CL突变体的突变位置和特征Table 2 The position and characteristics of different rice mutants

7 展望

虽然CL物种的研究在迅速发展，但由于大自然庞大的植物物种数，许多未知的CL植物有待人们去发掘和鉴定。而JSTOR目前报道的CL物种数目仅仅是其中很小的一部分，且其分类群的研究更是少之又少。对于已知的闭花授粉物种，多数研究主要集中在重要作物的生物学特性观察、花器官形态学比较以及对环境适应性的响应等方面，对其产生和作用的机理未进行深入研究。所以今后的研究可以从表型和现象观察过度到更加深入的分子和机理方面，如CL物种的转基因、其形成的机制以及系统进化关系三方面进行研究。

第一，挖掘更多CL特性基因并培育具有CL基因的转基因新品种。CL小麦对穗部病害赤霉病的抵抗力比CH小麦更高[87]，CL小麦完成授粉后，病虫不易入侵。葡萄(Vitislabruscana)在环境适宜条件下进行CH，但花期长时间遭遇阴雨或人为因素等则可通过CL完成繁衍后代的目的[88]。这种CL的特性是植物在长期进化过程中有效抵御不良环境的一种发育策略。另外，由于CL的颖花不张开，花药不外露，花粉不会向外传播，能使植物避免外来花粉干扰而保持纯种，因此在不影响其它农艺性状的前提下，培育具有CL特性的转基因新品种是抑制基因漂流、减少环境风险的一种理想策略。

第二，发现闭花授粉的生殖和生态信息。多数物种的CL表达受环境影响，其中大部分物种的生殖和生态信息尚未报道。例如，对单株、群体内部以及单株和群体之间花类型的变化进行量化。另外，在一些物种中应明确指出CL表达是受环境的单一影响还是受遗传和环境相互作用的影响。

第三，对闭花授粉花的发育生物学进行分析。在闭花授粉的3种类型中，分别对花类型的发育生物学进行详细描述，尤其对处于不同种群的花。然后通过进一步研究环境对花基因表达的影响，可能会更好地理解影响花由CH转变为CL的直接因素和闭花授粉在被子植物中的进化。

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(责任编辑 王芳)

Advances in cleistogamy of angiosperms

Zhang Dai-yu, Luo Kai, Wu Fan, Wang Yan-rong, Zhang Ji-yu
(State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

Cleistogamy (CL), a breeding system in which permanently closed and self-pollinated flowers are produced, has

increasing attention in recent years. The present study summarised the different types of cleistogamy, the variation of floral organs, their distribution in angiosperms, phylogenetic evolution, and related regulatory genes. There are three types of cleistogamy: dimorphic, complete, and induced cleistogamy. Among them, the occurrence of dimorphic cleistogamy is 77.3%. Cleistogamy is present in 705 angiosperm species, distributed across 236 genera and 53 families. Compared with chasmogamy (CH), the number of floral organs in cleistogamous flowers is reduced and the lodicules are degraded. Genetic control of cleistogamy involves one to three genes.Cleistogenessongoricais a representative plant with dimorphic cleistogamy. The morphology of CH and CL flowers revealed a significant difference, and the seeds are heteromorphic. The phylogenetic tree of the genera in Poaceae indicated that the relationship betweenCleistogenesandDiplachne, belonging to Tridentinae, is closer than originally presumed. Such information will provide valuable background for understanding the ecological significance and role of genes in cleistogamy.

cleistogamy; chasmogamy; phylogenetic evolution; cleistogamy related genes; angiosperms

Zhang Ji-yu E-mail:zhangjy@lzu.edu.cn

2017-01-07 接受日期：2017-03-24

科技部“973”课题(2014CB138704)；国家自然科学基金(31572453、31101759)；兰州大学中央高校基本科研费自由探索项目(lzujbky-2016-10)

张代玉(1989-)，女，甘肃靖远人，在读硕士生，研究方向为作物栽培与耕作学。E-mail:zhangdy2014@lzu.edu.cn

张吉宇(1977-)，男，甘肃民乐人，副教授，博导，博士，研究方向为草类作物育种与生物技术。E-mail:zhangjy@lzu.edu.cn

10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0028

Q944.42

A

1001-0629(2017)06-1215-13

张代玉，骆凯，吴凡，王彦荣，张吉宇.被子植物闭花授粉的研究进展.草业科学,2017,34(6)：1215-1227.

Zhang D Y,Luo K,Wu F,Wang Y R,Zhang J Y.Advances in cleistogamy of angiosperms.Pratacultural Science，2017,34(6)：1215-1227.