Cd胁迫对水稻叶NR活性、GS活性和可溶性蛋白质含量的影响

谢斯斯+卢维盛+吴道铭+钟辉祥+陈远+陈伟彬+黄家欢+陈贵然+张慧敏+吴祝拓

摘要：通过盆栽试验，以籼稻培杂泰丰和粳稻日本晴为供试水稻品种，研究了Cd胁迫对水稻NR（硝酸还原酶）活性、GS（谷氨酰胺合成酶）活性和可溶性蛋白质含量的影响。结果表明，Cd胁迫对水稻叶GS活性和 NR活性均表现为低促高抑或抑制作用，在不同时期和不同品种间表现不同。随环境（土壤）镉浓度的上升，日本晴叶可溶性蛋白质含量呈现先上升后下降的趋势，而培杂泰丰则保持上升趋势。培杂泰丰比日本晴具有更高的Cd耐受能力。

关键词：水稻；Cd胁迫；NR；GS；可溶性蛋白质

中图分类号：S161.2+1 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2017）03-0201-04

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.03.110

Abstract： Pot experiment was carried out to study the effect of cadmium（Cd） stress on NR activity ，GS activity and soluble protein content in rice leafes. The tested rice varieties were Peiza Taifeng and Nipponbare. The results showed that NR activity and GS activity all tended to promote weakly and inhibited with increase of Cd concentration. With the Cd application， the content of soluble protein in Nipponbare leafes firstly increased and then decreased， while Peizataifeng was to maintain an upward trend. Peizataifeng had higher Cd tolerance than Nipponbare.

Key Words： rice；N-Cd；NR；GS；soluble protein

近年来，随着工农业生产和城市化的发展，农田土壤中重金属污染问题日益突出，进而影响到我国的稻米质量安全[1]。水稻作为我国最重要的粮食作物之一，对Cd具有较强的吸收和耐受能力[2]，存在稻米Cd超标风险。小剂量镉可提高或加速某些生理生化反应，而大剂量则对植物产生抑制和毒害，有人把此现象解释为镉在低浓度时对植物有一定的“刺激作用” [3]。但重金属不论其浓度如何，对植物的生理生化过程都是有害的，只不过植物对重金属的反应是一个过程中的两种作用的复合效应[4]。Cd可以通过影响游离氨基酸、可溶性蛋白含量以及植物体内的酶系统而扰乱植物的各种生理生化代谢过程[5]，Cd对水稻毒害主要表现为氧化损伤，影响植物的抗氧化系统和光合作用、呼吸作用等生理代谢过程[6]。镉胁迫造成植物体内一些大量和微量元素吸收与分配发生混乱，其中氮代谢失调是植物镉毒害的重要原因，氮素代谢作为植物生长发育中一个重要的营养代谢途径，其多种中间代谢产物或含氮有机物对缓解环境不良因子起着重要的作用，镉胁迫环境下植物保持正常的氮代谢是它对镉毒害具有一定耐性的表现[7]。本试验选用籼稻培杂泰丰和粳稻日本晴为供试水稻品种，采用土培方法，研究了N-Cd交互处理对水稻氮代谢酶活性和可溶性蛋白质含量的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品种为培杂泰丰（籼稻）和日本晴（粳稻），种子由华南农业大学农学院提供。盆栽土壤取自华南农业大学试验田的农田水稻土，土壤自然风干后，过5mm筛。土壤基本理化性状见表1，具体分析方法参见《土壤农业化学分析方法》[8]。

1.2 试验设计

盆栽试验在华南农业大学温室内进行。设4个Cd水平0.0、1.0、3.0和5.0 mg·kg-1土（以纯Cd计，CdCl2·2.5H2O为Cd源），设2个氮（尿素为氮源）水平N100、N200 mg·kg-1土（以纯N计）。按照常规进行水分管理。

1.3 测定

分别于抽穗期和成熟期取样测定。采取叶鲜样，将洗净擦干的水稻新鲜绿叶，混匀后称取约10g剪碎，于-20℃冰箱中保存备用，用于酶活性测定。

1.3.1 硝酸还原酶（nitrate-reductase，NR）活性测定

0.5g水稻鲜叶+7.5ml提取缓冲液（1.211g半胱氨酸 + 0.372g EDTA，溶于1L 0.025 mol·L-1 pH8.7的磷酸缓冲溶液），研磨成匀浆，转移到离心管中于4℃、4000 r·min-1下离心15min，上清液即為粗酶提取液。0.4ml粗酶提取液+1.2ml 0.1 mol·L-1 KNO3溶液+ 0.4mlNADH溶液后混匀（对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1 mol·L-1 pH 7.5磷酸缓冲液代替），在25℃水浴中保温30min。保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml 0.2% a-萘胺溶液，显色反应15min后于4000 r·min-1下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算NR活性，单位表述为μg ·g-1·h-1[9]。

1.3.2 谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性测定

1g水稻鲜叶+8ml pH7.2磷酸提取液（0.146g EDTA·L-1提取液），研磨成匀浆，转移到离心管中于4℃、18000 r·min-1下离心20min，上清液即为粗酶提取液。酶粗液1ml+0.6ml咪唑-盐酸缓冲液（0.25mol·L-1，pH7.0）+0.4ml谷氨酸钠溶液（0.30mol·L-1，pH7.0）+0.4ml ATP-Na溶液（30mmol·L-1，pH7.0）+0.2ml MgS04溶液（0.5 mol·L-1）。反应液在25℃水浴中保温5 min后，加入0.2ml羟胺试剂开始反应，25℃水浴中保温15 min后，立即加入1ml 酸性FeCl3试剂终止反应。混合液在4000 r·min-1离心15min，测定上清液在540nm处的光密度。总活性为：每克鲜样酶粗液在15min的反应时间内消光值的变化量，单位表述为△OD·g-1·min-1[10]。

1.3.3 可溶性蛋白质含量测定

0.2g水稻鲜叶+5ml磷酸提取液（pH7.0），研磨成匀浆，转移到离心管中于4000 r·min-1下离心20min，上清液倒入10ml容量瓶中，定容至刻度。取 0.1ml 样品提取液+0.9ml蒸馏水+ 5ml考马斯亮蓝G-250混匀，放置5min后在595nm下比色。根据回归方程计算蛋白质含量mg/g[9]。

1.4数据处理

试验中数据用Excel和SPSS进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 水稻不同时期叶谷氨酰胺合成酶（GS）活性

从图1和图2可知，从抽穗期到成熟期，无Cd处理的水稻叶GS活性有所上升，而有Cd处理的叶GS活性明显下降，Cd胁迫使水稻后期氮素同化能力下降。抽穗期，随着Cd处理浓度上升，水稻叶GS活性呈现先上升后下降的趋势，但两水稻品种叶GS活性对Cd处理的反应不同，日本晴是在Cd 1.0 mg·kg-1土时升至最高后下降，而培杂泰丰是在Cd 3.0 mg·kg-1土时升至最高后有所下降。成熟期，Cd处理对水稻叶GS活性主要表现为抑制作用，尤其对培杂泰丰。

2.2 水稻不同时期叶硝酸还原酶（NR）活性

分析图3和图4可知，抽穗期两品种水稻叶NR活性无明显差异，但成熟期培杂泰丰叶NR活性显著高于日本晴。从抽穗期到成熟期，水稻叶NR活性显著下降，有Cd处理的下降幅度高于无Cd处理的。Cd处理对日本晴叶NR活性表现为抑制作用，而对培杂泰丰则表现为明显的低促高抑。

2.3 水稻不同时期叶可溶性蛋白质含量变化

由图5和图6可知，从抽穗期到成熟期，两品种水稻叶可溶性蛋白质含量明显减少。随Cd处理浓度的上升，日本晴叶可溶性蛋白质含量呈现先上升后下降的趋势，而培杂泰丰则保持上升趋势。

2.4 水稻叶GS活性、NR活性和可溶性蛋白质含量的方差分析

由表2可知，水稻叶NR活性和可溶性蛋白质含量与因素间存在显著线性相关性。水稻叶GS活性、NR活性和可溶性蛋白质含量随时期的变化而明显变化；Cd处理对水稻叶可溶性蛋白质含量具显著影响，培杂泰丰NR活性对Cd处理的响应显著高于日本晴，而日本晴GS活性对Cd处理的响应显著高于培杂泰丰的；N施用量对水稻GS活性和可溶性蛋白质含量影响显著，尤其对日本晴。

3 讨论与结论

在胁迫条件下，必需元素尤其是硝酸盐的变化，能引起基因表达和酶活性的变化，在一些植物中，镉对硝酸盐及其同化都产生影响[11]。谷氨酰胺合成酶（GS）是处于氮代谢中心的多功能酶，参与多种氮代谢的调节，其活性的高低可以反映氮素同化能力的强弱 [12]。硝酸还原酶（NR）是植物同化硝酸盐的限速酶，以硝酸还原酶为中心的调控系统是植物最原始、最基本的氮代谢调控系统，在水稻氮素代谢过程中起关键作用[13]。有研究证实，细胞中可溶性蛋白质含量的增加，一方面可与Cd2+ 形成镉结合蛋白（Cd-BP），Cd-Bp的形成限制了自由态Cd2+的存在，减轻了镉对植物的毒害；另一方面可提高功能蛋白的数量，增加细胞渗透势，有助于维持细胞正常代谢，提高植物的抗逆性[14]。镉胁迫下，水稻幼苗叶片可溶性蛋白含量、脯氨酸含量及硝酸还原酶活性明显增加[15]。本研究表明，Cd处理对水稻叶可溶性蛋白质含量具显著影响，培杂泰丰NR活性对Cd处理的响应显著高于日本晴，而日本晴GS活性对Cd处理的响应显著高于培杂泰丰。从抽穗期到成熟期，无Cd处理的水稻叶GS活性有所上升，而有Cd处理的叶GS活性下降；叶NR活性明显下降，但有Cd处理的下降幅度高于无Cd处理。Cd处理对水稻叶GS活性和 NR活性均表现为低促高抑或抑制作用，具体表现与时期和品种有关，对抽穗期水稻叶GS活性表现为明显的低促高抑，而对成熟期水稻叶GS活性则主要表现为抑制作用；对日本晴叶NR活性主要表现为抑制作用，而对培杂泰丰则表现为低促高抑。总的来说，培杂泰丰叶GS活性和 NR活性对Cd的耐受能力高于日本晴。随环境（土壤）镉浓度的上升，日本晴叶可溶性蛋白质含量呈现先上升后下降的趋势，而培杂泰丰则保持上升趋势。培杂泰丰比日本晴具有更高的Cd耐受能力。

参考文献

[1]牟仁祥，陈铭学，朱智伟，应兴华.水稻重金属污染研究进展[J].生态环境，2004，13（3）：417-419.

[2]鲁如坤，熊礼明，时正元.关于土壤-作物生态系统中镉的研究[J].土壤，1992，24（3）：129-132.

[3]林冬，朱诚，孙宗修.镉敏感水稻突变体在镉胁迫下活性氧代谢的变化[J].环境科学，2006，27（3）：561-566.

[4] 柯庆明，林文雄，梁康迳等.水稻抗Cd胁迫的生理生化特性研究[J].农业资源与环境科學，2008，24（4）：374-377.

[5] Hou W H， Chen X， Song G L et al.Effects of copper and cadmium on heavy metal polluted water bodies to ration by duckweed（Lemnaminor）.Plant Physiology and Biochemistry，2007，45（1）：62-69.

[6]SRIVASTAVA R K， PANDEY P， RAJPOOT R， et al. 2014. Cadmium and lead interactive effects on oxidative stress and antioxidative responses in rice seedlings [J]. Protoplasma， 251（5）： 10417-1065.

[7]Gussarsson M， Asp H， Adalsteinsson S et al. Enhancement of cadmium effects on growth and nutrient composition of birch （Betulapendula） by buthionine sulphoximine （BSO）.Journal of Experimental Botany， 1996， 47（2）：211-215

[8]鲁如坤.土壤农业化学与分析方法[M].北京：中国农业出版社，2000.308-336.

[9]陈建勋，王晓峰.植物生理学实验指导[M].广州：广州华南理工大学出版社，2006.13-16.

[10]赵全志，陈静蕊.刘辉.水稻氮素同化关键酶活性与叶色变化的关系[J].中国农业科学，2008，41（9）：2607-2616.

[11] Hernndez L E， Garate A， Carpena-Ruiz R.Effects of cadmium on the uptake，distribution and assimilation of nitrate in Pisum sativum.Plant Soil， 1989， 189（1）：97-106.

[12] 王月福，于振文，李尚霞等.氮素营养水平对冬小麦氮代谢关键酶活性变化和籽粒蛋白质含量的影响[J].作物学报，2002，28（6）：743-748.

[13]张智猛，万书波，宁堂原等.氮素水平对花生氮素代谢及相关酶活性的影响[J].植物生态学报，2008，32（6）：1407-1416.

[14] 黄秋婵，黎晓峰，李耀燕.镉对水稻的毒害效应及耐性机制的研究进展[J]. 安徽农业科学，2007，35（7）：1971-1974.

[15] 张伟锋，陈平.镉对水稻幼苗叶片几种元素含量的影响[J]. 农业与技术，2004，24（5）：65-67.

[16]邵国胜，谢志奎，张国平.杂草稻和栽培稻氮代谢对镉胁迫反应的差异[J].中国水稻科学，2006，20（2）：189-193.

收稿日期：2017-05-12

作者简介：谢斯斯（1984-），女，硕士研究生，中级环保工程师，研究方向为环境保护。