细鳞鱼3种气单胞菌SSCP快速检测方法的建立

杜迎春++时晓++陈春山++李博++刘宁

摘 要 采用PCR-SSCP（聚合酶链反应-单链构象多态性）方法直接提取细菌DNA进行分子生物学检测，通过扩增细菌16S rDNA的V3区保守序列，扩增产物变性后，进行SSCP分析，建立杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌的SSCP特异性图谱。该方法可快速准确地检测出养殖水体及病鱼体上的致病菌，在生产实践上有重要意义。

关键词 PCR-SSCP；杀鲑气单胞菌；嗜水气单胞菌；温和气单胞菌

中图分类号：S941 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.06.051

细鳞鱼又称细鳞鲑，属鲑形目、鲑科、细鳞鱼属，该鱼在中国仅1属1种，是一种名贵的鲑科陆封型冷水鱼。在细鳞鱼的驯养繁育过程中，各种疫病成为制约其发展的瓶颈问题，其中，气单胞菌是引起鱼类疾病的重要病原菌。

杀鲑气单胞菌主要是鲑、鳟鱼的病原菌，但近年来也有感染大菱鲆、鲽等其他鱼类的报道；嗜水气单胞菌在水体中广泛存在，可引起鱼类及其他水产养殖动物的多种病害。温和气单胞菌也能引起多种水产养殖动物感染发病，且大多情况下是多种细菌混合感染。

传统的病原菌鉴定方法虽较为经典，使用广泛，但操作繁琐，周期较长，而水生动物致病菌多为条件性致病菌，快速准确地检测出致病菌对于病原的确定及诊治尤为重要。本研究就是利用分子生物学的方法，建立杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌的PCR-SSCP快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

实验鱼是北京市水生野生动植物救护中心驯养繁育的细鳞鱼。

1.1.2 试剂仪器

普通营养琼脂、营养肉汤培养基，均购自北京陆桥技术有限责任公司；2× Es Taq Master Mix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，均购自北京康为世纪公司；DL2000 DNA Marker，购自北京艾德莱生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离

病魚鳃盖、鳍基及鱼体两侧出血、充血，严重的病鱼体表充血甚至出血（如见图1所示）。腹腔内有淡黄色透明或红色浑浊腹水。无菌采取患病细鳞鱼病灶、肝脏、脾脏、肠等器官，用接种环划线接种于普通营养琼脂上。挑取单个典型菌落接种到营养肉汤培养基，25 ℃过夜培养。

图1 患病细鳞鱼

1.2.2 病原菌PCR扩增

取分离培养的肉汤培养物，提取基因组DNA。用提取的DNA作为模板，扩增细菌16S rRNA V3区保守序列基因。基因扩增通用引物27F和1492R，引物序列如下。

27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3；

1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。

引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

PCR 扩增反应体系为25 μL：上游引物1 μL，下游引物1 μL，2× Es Taq Master Mix：12.5 μL，模板1 μL，双蒸水9.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性

5 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，PCR产物纯化回收后，由北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.2.3 病菌SSCP图谱建立

将PCR产物98 ℃变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子。变性产物利用10% PAGE胶电泳。通过放射性自显影、银染、溴化乙锭分析SSCP电泳图谱。

2 结果

2.1 细菌培养

嗜水气单胞菌在普通营养琼脂上，长成圆形光滑、边缘整齐、隆起、半透明或不透明、灰白色的菌落。杀鲑气单胞菌在普通营养琼脂上24 h生长成菌落直径0.3～0.4 mm灰白色、较不透明、隆起、边缘整齐的菌落。

2.2 PCR扩增

PCR扩增得到171 bp目的条带。将扩增产物进行纯化回收后，送华大公司测序。将测序序列提交NCBI进行BLAST比对分析，确定目的基因片段分别是杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌。

2.3 SSCP

PCR变性产物经多次重复电泳后，确定每种细菌图谱的特异性、重复性及准确性。杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单细胞菌的SSCP图谱见图3，建立了特异性PCR-SSCP快速检测方法。

3 讨论

气单胞菌引发的疫病是细鳞鱼人工养殖中的高发疫病，其中嗜水气单胞菌、温和气单细胞菌、杀鲑气单胞菌等气单细胞菌引起的疫病最为常见，危害也最为严重，一旦发病常常会带来毁灭性损失。因此建立气单胞菌病源的快速检测方法，对于疫病的早期防控和治疗尤为重要。而传统的分离培养、生理生化等基础检测手段，由于灵敏度低、特异性差、费时耗工，已不适应当前水产养殖业对疫病早期防控及时治疗的需要。本研究采用SSCP方法直接提取细菌DNA进行分子生物学检测，通过扩增细菌16S rDNA的V3区保守序列，进行变性电泳后，建立3种气单胞菌的特异性SSCP图谱，可用于病源的快速检测分析。PCR-SSCP快速检测方法的建立，可将病源的检测时间控制在2 d以内，重复率可达到95%以上，准确率可达到90%以上，该方法所需仪器简单、操作方便、适宜在普通实验室推广应用。

（责任编辑：刘昀）