药用植物分子育种展望

马小军+莫长明

[摘要] 分子辅助育种、转基因育种和分子设计育种是植物分子育种学三大发展方向。该文就此3个育种方向的遗传连锁作图、QTL定位作图、关联分析作图、分子辅助选择、花粉管通道介导转化、农杆菌介导转化、基因枪介导转化、基因编辑技术、全基因组测序、转录组测序、蛋白组测序和品种分子设计等研究领域的发展现状和新趋势进行概述，并结合药用植物分子育种目标和存在问题的探讨，展望了此3种分子育种技术在药用植物分子育种中的应用前景。

[关键词] 药用植物育种；分子辅助育种；转基因育种；分子设计育种

[Abstract] The molecular-assisted breeding，transgenic breeding and molecular designing breeding are three development directions of plant molecular breeding. Base on these three development directions，this paper summarizes developing status and new tendency of research field of genetic linkage mapping，QTL mapping，association mapping，molecular-assisted selections，pollen-mediated transformations，agrobacterium-mediated transformations，particle gun-mediated transformations，genome editing technologies，whole-genome sequencing，transcriptome sequencing，proteome sequencing and varietal molecular designing. The objective and existing problem of medical plant molecular breeding were discussed the prospect of these three molecular breeding technologies application on medical plant molecular breeding was outlooked.

[Key words] medical plant breeding；molecular-assisted breeding；transgenic breeding；molecular designing breeding

分子育种是分子生药学的一个重要内容。所谓分子育种就是将分子生物学技术应用于育种中，在分子水平上进行育种，它是常规育种的一个新发展。常规育种注重表型选择，而分子育种强调基因型选择。分子育种离不开常规育种，它也同样以优异表型为育种目标，并建立起基因型和表现型之间的联系，通过基因型来选择表现型。药用植物育种是改善药材品质的重要途径。近20年来，人们通过系统选育、杂交育种、多倍体育种等常规育种方法，已培育出了人参、西洋参、地黄、丹参、罗汉果、松蓝、柴胡、桔梗、枸杞、厚朴等许多中药材新品种。但是，由于药用植物种类多、生长周期长、杂合度高、育种目标特殊等原因，使得药用植物育种的总体水平较低，育种效率不高。分子育种具有快速、高效、准确等特点，是未来药用植物育种学的发展方向。为此，本文对分子育种学的3个主要研究方向——分子辅助育种、转基因育种和分子设计育种的基本概念和技术进行简要叙述，同时探讨药用植物分子育种存在的问题并展望其应用前景，以期引起同行关注，促使更多的科技工作者投入到药用植物分子育种工作中来。

1 分子辅助育种

分子辅助育种是分子育种研究和应用最多的一个方向。分子辅助育种的原理是把与待研究的表现型刻划在DNA遗传图谱上，通过DNA检测就可以快速、简便地进行选择。开展分子辅助育种通常包含遗传图谱构建、数量性状位点（QTL）定位、性状关联分析和优良种质筛选4个相互联系又有一定独立性的研究内容。

1.1 遗传连锁作图 遗传连锁图谱构建包括3步：①选择建立适宜的遗传作图群体；②选择合适类型的遗传标记，筛选多态性标记，检测遗传作图群体个体或家系基因型；③确立遗传标记连锁群、排列顺序和距离并绘制图谱[1]。选择合适的遗传作图群体是成功、高效构建完整、高密度遗传图谱及定位QTL的关键。植物用于遗传作图群体按遗传稳定性可分为F2，F3，F4，BC1，三交等暂时性分离群体和RIL，DH，IF2等永久性分离群体。每类作图群体各有优缺点[2]，会影响遗传连锁作图效率和精度。这些群体都已被广泛用于自花授粉植物的遗传连锁作图。然而，自交不亲和、近交退化、生长周期长的异花授粉植物，较难获取纯合株系，通常以杂交F1[3]，F2和回交群体作为遗传作图群体[4]，并结合拟测交策略[5]构建遗传连锁图谱。因此，遗传连锁作图时应结合具体情况选择不同类型的分离群体。遗传连锁图谱的分辨率和精度，很大程度还取决于群体的大小。群体越大精度越高，但工作量与费用大大增加。遗传连锁框架图谱构建可采用大群体中的随机小群体（150个单株或家系），需要精细定位某一连锁区域时，通常扩大到1 000个以上单株的群体。

遗传连锁作图主要分子标记有RFLP，SSR，RAPD，ISSR，AFLP，SNP，SRAP等。每种分子标记各有优缺点，例如SSR具有多态性丰富、覆盖整个基因组、共显性、稳定可靠等优点，但引物开发需要已知序列、成本高[6]；RAPD需要DNA量少、多态性高于RFLP、实验操作简单，但不能區分显性纯合和杂合基因型、结果重复性差、不适合品种水平分析[7]；SRAP具有简单、可靠、通量较高、编码区片段比例较高、共显性等特点，能很好定位基因组中开放阅读框[8]；AFLP可靠、高效，但为显性标记、引物需要标记、技术与设备要求高、标记分布不均匀[9]。SNP在基因组中分布较SSR标记广泛，共显性或显性、稳定性高、基因内部SNP可能直接影响表型、易于自动化[10]。遗传连锁作图时，应针对特定物种，根据具体情况，从标记多态性、显性、稳定性和实验操作难易度、费用比等多方面综合考虑。

遗传连锁作图包括遗传标记分离、连锁关系、排序分析和遗传距离估算等步骤，开发有MAPMAKER/EXP[11]，Joinmap[12]，CarthaGene[13]等多种作图软件。这些软件在数据准备难易、可视化程度和功能等方面存在较大不同。其中，广泛使用的有MAPMAKER/EXP 3.0，Joinmap 4.0等软件。MAPMAKER/EXP 3.0适用于BC1，F2，RIL等群体遗传连锁图谱构建及复合性状基因定位。Joinmap 4.0适用于BC1，F2，RIL，DH等群体遗传连锁图谱构建及整合。

遗传连锁图谱还难于直接在育种中发挥作用，主要用于QTL定位、基因克隆、性状遗传分析和基因组比较研究，其饱和度直接影响到QTL定位精确性。因此，构建高密度遗传连锁图谱对QTL定位十分必要。遗传连锁图谱上标记平均间隔，连锁框架图谱要求不大于20 cM；主效基因定位要求在10～20 cM或更小；QTL定位要求在10 cM以下；基因克隆要求目标区域在1 cM以下[14]。现有遗传连锁图谱多数是由不同群体、标记、研究者、实验条件下所构建的，饱和度不够高。多标记多群体作图增加标记位点和图谱整合是增加遗传连锁图谱饱和度的有效途径。在具备共有标记可用条件下，可直接采用“锚定标记策略”，将不同遗传连锁图谱整合成一张公共图谱、一致性图谱。这不仅可以增加图谱的饱和度，还可以扩展图谱的应用范围。在无共有标记可用条件下，可先用以往的作图群体开发共有分子标记再进行图谱整合。分子遗传连锁图谱虽然发展很快，但是若不与形态、同工酶、细胞学等常规标记结合起来，其在育种中应用价值有限制。因此，必须借助FISH等技术将分子遗传连锁图谱与经典遗传图谱、细胞遗传图谱整合成一张综合遗传图谱。这不仅是重要农艺性状准确定位需要，也是图位克隆分离目的基因的需要。

1.2 QTL定位作图 QTL定位作图的原理与常规育种中通过表现型3点测验估算交换值来确定基因顺序的原理是一样的，只是表现型换成了“虚拟基因”QTL。其步骤包括：①构建遗传连锁图谱；②检测与记录分离群体中个体的遗传标记基因型和数量性状表型值；③应用适宜统计方法和软件，确定QTL在连锁群或染色体上位置，估算QTL遗传效应参数，并绘制图谱。为了提高作图精度、效率以及更好估算QTL效应，QTL定位作图统计方法不断发展。最初QTL定位作图广泛使用的是单标记分析法[15]，但其存在无法确切估算QTL位置、低估QTL遗传效应、需求个体数量多等诸多问题。因此，Lander和Bostein[16]以一元回归分析与极大似然法为基础，借助于完整分子连锁图，提出了区间作图法，其具有近无偏估计QTL位置与效应、所需个体数量较少等优势，伴随相应软件Mapmaker/QTL推出而被广泛应用，但也存在一次仅能检验2个标记，无法检测上位性和基因型与环境互作等不足。Zeng[17]进一步将多元回归分析与极大似然法结合，整合其他遗传标记控制遗传背景效应，提出了复合区间作图法，其保持了区间作图法的优点，同时提高了作图精度和效率，但仍存在无法分析上位性和基因型与环境互作，多个连锁QTL遗传方差估计困难等缺点。针对上述定位作图方法不足，Kao等[18]引入Cockerham模型，多区间上多个QTL同时检测，突破了回归方法的局限，提出多重复区间作图法，改进了QTL定位作图的精确度和有效性，其还可估计QTL间上位性、个体基因型值与数量性状遗传力，但如何确定合适临界值缺乏理论支持。针对无法分析复杂遗传现象及环境作用基因效应，影响重要农艺性状精细定位与遗传效应分析问题，朱军等[19]又提出了基于混合线性模型的复合区间作图法。该方法可分析QTL上位性各项遗传主效应及其与环境互作效应进行QTL定位，但效应检测灵敏度有限。QTL定位作图统计分析复杂，依靠计算机来完成非常必要，开发推出有Mapmaker/QTL[16]，QTL Cartographer[20]，QTLMAPPER[21]，IciMapping[22]，QTLnetwork[23]等多种软件。

QTL定位的重要目标是为分子辅助育种提供选择标记和分离克隆QTL上的基因。目前QTL定位群体多为F2，BC1等初级定位群体，遗传背景较复杂、重组率有限和田间实验无法重复，影响QTL定位的准确性和稳定性，大多数QTL定位精度不高、在10～30 cM[24]。这一精度无法区分所定位QTL是单个基因还是数个QTL连锁的多基因组成，无法满足基因分离克隆需要。通常情况下，10～30 cM区域基因组很可能包含控制同一性状、效应相反的几个QTL。这会影响性状改良时在这一区域的遗传获得量和育种值。因此，要进一步理解QTL遗传结构和分离克隆QTL，QTL精细定位十分重要。为了提高基于QTL精细定位效果，必须构建近等位基因系、回交近交群体和单片段代换系等永久性次级定位群体，开展多年多点重复实验，消除群体内遗传背景和环境的干扰。这些群体的株系，除目标性状外，遗传背景基本一致，遗传背景干扰效应被降低至最小，将极大提高了QTL定位的精度，有助于通过染色体登录和步移法实现QTL的克隆。

1.3 关联分析作图 关联分析作图也称连锁不平衡作图，是一种以连锁不平衡为基础，鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法[25]。关联分析作图有4个步骤[26]：①种质材料的选择（尽可能包括物种全部表型和遺传变异），其中核心种质是进行连锁不平衡作图最佳选择；②运用基因组范围内独立遗传标记（SSR，SNP，AFLP）和STRUCTURE软件分析群体结构；③目标性状选择及其表型鉴定；④全基因组扫描或候选基因关联分析。相比遗传连锁分析，关联分析作图具有3个优点：①一般以现有自然群体和人工群体为材料，无需专门构建作图群体；②可同时检测作图群体一个座位上的多个等位基因；③可定位数量性状基因座位甚至单个基因本身，精度高[24-25]。遗传连锁作图定位的QTL与目标基因常相距1 cM以上，分子辅助育种中易发生目标基因丢失或连锁累赘，而关联分析作图鉴定的标记可达单个基因水平，可极大提高辅助选择的准确性和育种效率。关联分析作图最初用于人类遗传疾病研究，2001年才首次引入到植物遗传研究中，发现了dwarf8基因与花期相关的SSR多态性位点[27]。关联分析作图包括标记水平的全基因组途径和序列水平的候选基因途径2种基本方法，可用于功能基因验证、功能性标记开发和数量性状QTL定位等研究。目前，主要集中在研究基因序列变异，转录后修饰与表型变异关联分析作图是未来发展的新方向[28]。虽然关联分析作图是挖掘优异等位基因的有效途径，但本身也具有局限性。关联分析作图效果很大程度上取决于群体中连锁不平衡强弱和分布。连锁不平衡程度和分布影响因素主要是突变和重组，此外还有群体结构、群体大小、遗传漂变等[29]。种质多态性不足够多时，关联分析作图存在统计能力降低，不如遗传连锁作图[30]。另外，遗传连锁作图更适合于全基因组的QTL扫描，关联分析作图则可对特定QTL进行更精细定位，二者进行QTL定位作图时是互补的，可先用遗传连锁作图进行初步定位，再用关联分析作图进行精细定位[30]。据此，Yu等[31]提出了将遗传连锁作图和关联分析作图相结合的巢式关联分析作图。

1.4 分子辅助选择应用 分子辅助育种方法分前景选择和背景选择，在携带目标基因单株选择、回交转育材料选择与评估和数量性状改良等方面有广泛应用。Izadi-Darbandi 和Yazdi-Samadi[32]针对高分子麦谷蛋白位点Glu-1，开发DNA标记进行辅助选择，获得了具有不同面包加工品质的伊朗普通小麦品种。Tanweer等[33]通过分子辅助前景选择法，将根据遗传连锁图谱图位克隆的稻瘟病抗性基因Pi-b[34]和Pi-kh[35]聚合到马来西亚主栽水稻品种MR219中，获得了具强稻瘟病抗性的纯合植株，分子辅助背景选择评估显示95%遗传背景与MR219一致，既提高了瘟病抗性又保持了品种原有优良性状，在保持MR219在农户中的高使用率和产量方面发挥了重要作用。Sureshkumar等[36]根据遗传连锁图谱上与低植酸lpa2-2等位基因紧密连锁标记，通过SSR标记辅助选择，回交培育出低植酸玉米品种。Lohithaswa等[37]在玉米F2群体中，鉴定出了3个具有高遗传力的高粱霜霉病抗性QTL，并通过分子辅助选择成功渗入到8个易感玉米品系中。Knoll 和 Ejeta[38]利用QTL辅助选择进行了高粱早期耐冷性筛选。Gao等[39]根据图位克隆的性别决定基因ACS7，WIP1和抗枯萎病基因Fom-2，设计分子标记进行辅助选择，筛选出了雌性抗枯萎病甜瓜品种。Zhang等[40]通过全基因组关联分析作图，证明大豆产量性状由许多微效位点控制，并利用鉴定的SNP标记和位点进行大豆产量的辅助选择，准确率达到0.75～0.87。此外，陈伟等[41]采用混合分离群体分析法（bulked segregant analysis，BSA）快速筛选出了2个油酸含量相关和4个亚麻酸含量相关的SSR标记，用于分子辅助选择育种，获得了遗传背景与回交亲本基本一致的高油酸和低亚麻酸植株。虽然，抗病分子辅助育种取得了明显进展，但是抗虫、品质改良、抗逆等分子辅助育种进展缓慢。这是由于现有遗传连锁图谱和QTL定位结果多源于一个或几个亲本组合，使得图谱饱和度和QTL稳定性低，不宜推广到更广泛的种质范围，多数还难于应用于分子辅助育种实践，尚需在育种亲本和种质群体中验证。虽然已构建长春花[42]、石斛[43]、柴胡[44]、罗汉果[45]、丹参[46]等数种药用植物遗传连锁图谱。但是，这些遗传连锁图谱均是采用单个F1或F2等非永久性分离群体构建，因而图谱饱和度和精度也较低，标记间平均距离都多在10.0 cM以上，性状紧密连锁标记缺乏，目前尚未见应用于分子辅助育种研究的报道。简化基因组测序技术可快速、高效构建高密度遗传连锁图谱和筛选性状相关标记，为解决图谱饱和度与精度较低问题提供了良好解决途径。例如，Zhang等[47]和刘甜[48]分别利用RAD-se，SLAF-seq构建了黄连花和丹参高密度遗传连锁图谱，标记间平均距离可达0.7 cM。

2 转基因育种

转基因育种是通过基因工程手段将一种或几种外源基因转移至某种植物，使其有效表达出相应的产物的一种分子育种方法。转基因的基本原理与常规杂交育种有相似之处：杂交是将整条基因链（染色体）转移，而基因转移是选取最有用的一小段基因转移，因此转基因比杂交具有更高的选择性。

2.1 常规转基因育种技术 转基因育种技术有农杆菌介导法、基因枪介导法、花粉管通道法、聚乙二醇介导法和电穿孔法等，其中农杆菌介导法、基因枪介导法和花粉管通道法为植物转基因育种最常用方法。农杆菌和基因槍介导法具有明显优势互补性，还融合发展出了农杆枪、粒子轰击农杆菌和菌体微单轰击转基因育种方法[49]。自从农杆菌介导法[50]、基因枪介导法[51]和花粉管通道法[52]创立以来，至今三者在农作物和园艺作物抗病、抗虫、抗逆等转基因育种中均取得了丰硕成果。利用农杆菌介导法，1987年，Bytebier等[53]首次成功转化单子叶植物获得石刁柏抗卡那霉素植株；1994年，Hiei等[54]首次成功转化禾本科植物水稻。农杆菌介导法具有转化频率高、插入片段大且确切、遗传表达稳定、技术与设备简单等优点，从而成为植物转基因育种应用最广泛的方法。基因枪介导法也因具有受体材料来源广泛（单子叶植物、双子叶植物）等优点，成为植物转基因育种应用第二多的方法。花粉管通道法因不受植物种类限制、操作简单、易普及推广，得到了一定程度的应用，最突出的成果就是培育出了推广面积最大的转基因抗虫棉品种。与农作物和园艺作物相比，药用植物转基因育种落后。农杆菌介导法主要在次生代谢产物合成方面有一定研究，由于再生体系和转化体系缺乏，成功获得转基因植株的研究较少，仅有青蒿[55]、罗汉果[56]和丹参[57]等数种植物。基因枪介导法也只有白术[58]和野甘草[59]等少量药用植物研究报道。药用植物花粉管通道法转基因育种尚未见有研究报道。

2.2 基因编辑育种技术 农杆菌介导法、基因枪介导法和花粉管通道法，3种转基因育种技术，外源基因都是随机整合到宿主基因组中去，转基因效果预见性不强，存在基因沉默和出现非预期变异问题。基因编辑技术具有靶向突变、删除、插入、替换目的基因[60]和可获得不含外源基因的非转基因植株[61]等优点，能很好弥补3种常规转基因育种方法存在的问题。它们相互结合已成为一种全新的、强有力的育种方法，正在迅猛发展。

1996年，Kim等[62]将ZFP（Zinc finger protein）特异识别DNA序列的锌指结构与核酸内切酶FokI的非特异性切割结构域人工串联重组融合，形成具有DNA切割功能的新嵌合体融合锌指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN），创立了第一代基因编辑技术ZFN。此后，经众多科学家不断改进，ZFN技术发展成为最成熟的基因编辑技术。2007年，Kay等[63]发现黄单胞菌分泌注入到植物细胞中的转录激活子类效应因子（transcription activator-like effector，TALE）可以特异性识别、结合和激活宿主植物特定基因表达。2010年，Christian等[64]将TALE特异性识别结合DNA的重复序列中央结构域与FokI的催化切割结构域进行串联融合，得到了能打断DNA双链的人工重组转录激活子类效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN），发展出了第二代基因编辑技术TALEN。2007年，丹麦的Barrangou等[65]首次证实成簇规律间隔短回文重复序列及其位点附近相关基因（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/ associated，CRISPR/CAS）是细菌的获得性免疫防御系统，用于特异性识别并降解清除外源核酸，以抵御病毒和质粒入侵。2012年，Jinek等[66]发现在crRNA和tracrRNA互补双链RNA引导下，CRISPR/CAS9系统能定向打断DNA双链，并提出在设计精妙的单链RNA引导下，该系统可用于基因编辑。2013年，Cong等[67]成功应用CRISPR/ CAS9系统对哺乳动物基因组进行多重基因编辑，开发出第三代基因编辑技术CRISPR/CAS9。2015年，Zetsche等[68]又发现了具有内切酶更易进入组织细胞、产生粘性末端、目标位点选择更灵活的全新CRISPR/CAS基因编辑系统CRISPR/Cpf1。最近，Gao等[69]还发明了古生菌Argonaute蛋白在DNA引导下进行基因组编辑的技术NgAgo，被誉为第四代基因编辑技术。

ZFN技术原理为，人工设计重组合成ZFN，导入到细胞中，通过锌指结构靶向特异性的DNA位点并结合，然后利用FokI核酸酶切割结构域剪切特定位点DNA，最后借助细胞内固有同源重组或非同源末端连接途径修复DNA缺口[70]，完成特定DNA序列的碱基突变、删除、插入和替换等编辑工作。除通过TALE重复序列中央结构域识别并结合特定DNA外，TALEN其他技术原理与ZFN技术类似。CRISPR/CAS9技术原理为，人工设计合成与特异DNA位点具有同源性的单链向导RNA（a singal guide RNA，sgRNA），并构建sgRNA和CAS9蛋白质粒载体，通过体外表达后注入或转化宿主细胞体内表达的方式，使sgRNA和CAS9蛋白得以在细胞内结合形成特异识别切割复合体，然后切割复合体在sgRNA同源互补结合引导下靶向特异DNA位点，在CAS9蛋白作用下进行DNA双链剪切，最后也是借助细胞内固有同源重组或非同源末端连接途径修复DNA缺口，完成特定DNA序列的碱基突变、删除、插入和替换等编辑。CRISPR/Cpf1技术与CRISPR/CAS9技术原理类似，不同是所使用的核酸内切酶不一样。通过农杆菌和基因枪介导法，ZFN，TALEN和CRISPR/CAS技术都已被用于烟草、水稻、小麦、番茄、葡萄、甘蓝、苹果、甜橙等[71-79]众多作物产量、抗病、抗除草剂、品质、雄性不育、开花基因靶向突变、删除、插入和替换研究。三者应用范围有较大重复，但三者又各有技术特点和适用范围。ZFN和TALEN技术，针对不同靶DNA序列，需要重新设计合成新核酸酶，实验繁琐、成本高。CRISPR/CAS技术仅需设计合成一个能够结合目标序列的短片段sgRNA，实验简单方便，但也存在脱靶率突出和目标序列附近下游必须存在PAM保守序列问题。NgAgo技术实验结果尚不稳定，仍需要进一步优化完善。

3 分子设计育种

分子设计育种是一种基于全基因組测序基础上的前沿分子育种方法，是对育种程序中的诸多因素进行模拟、筛选和优化，提出最佳目标基因型以及实现目标基因型的亲本选配和后代选择策略，以提高作物育种中的预见性和育种效率，实现从传统的“经验育种”到定向、高效的“精确育种”的转化。

3.1 基因组研究进展 基因组研究包括以全基因组测序为代表的结构基因组学和以转录组、蛋白组等为代表的功能基因组学。全基因组测序遗传图谱、物理图谱和转录图谱是分子设计育种的蓝图。转录组测序分离鉴定的基因以及揭示的化合物合成、信号转导、性状控制调控网络是分子设计育种重要理论基础。采用第一代DNA双脱氧核苷酸末端终止法与化学降解法测序技术完成了拟南芥[80]、水稻[81]、杨树[82]等模式植物基因组测序。伴随第二代高通量、低成本的454，Solexa，SOLiD测序技术的广泛应用，黄瓜[83]、玉米[84]、大豆[85]等越来越多作物也相继完成了基因组测序，涵盖粮食、园艺和油料作物[86]。NCBI数据库中已收录了150多种植物的基因组数据。药用植物受遗传背景不清、杂合度高、序列重复性多等因素限制，基因组测序起步晚，研究远不及农作物。2010年才完成首个药用植物丹参基因组框架图，随后相继完成了人参和灵芝基因组测序。近年随着读长更长（可达10 kb）的第三代SMRT单分子实时测序技术成熟推出，解决了第二代测序技术海量数据拼接难、高GC含量区域无法跨越和高度重复片段无法准确测定等问题，将二代和三代测序技术优势互补结合，完成了首个高杂合、高重复序列木本药用植物杜仲基因组精细图的构建。伴随药用植物基因组测序计划的开展，罗汉果等越来越多的药用植物基因组信息也将可获得。由于获取信息多、成本较低、简单高效等优点，简化基因组测序也正蓬勃发展，包括RAD-seq，GBS，SLAF-seq等技术，已被用于众多植物的复杂性状连锁标记开发[87-89]、高密度遗传图谱构建[90-93]、QTL精细定位[93-95]、群体遗传结构与多样性分析[96-97]等研究。此外，药用植物转录组研究更是发展迅速，先后进行了青蒿、丹参、西洋参、红豆杉、三七、柴胡、红花、金银花、地黄、人参等40多种药用植物研究[98]，且在人参三萜皂苷、红花黄酮、丹参酮关键酶基因鉴定[99-101]和长春花、罗汉果化合物代谢途径解析[102-103]等方面取得了长足进展。

3.2 分子设计育种进展 2003年，荷兰科学家Peleman和van der Voort首次提出分子设计育种概念[104]。分子设计育种是以生物信息学为平台，以基因组学、蛋白组学和种质信息等相关数据为基础，综合育种过程中所有学科的有用信息，根据作物育种目标和生长环境，在计算机上虚拟设计筛选出最佳目标基因型和育种方案，然后据此开展作物育种实验的分子育种方法。分子设计育种是一种从传统“经验式”到“定向、高效、精准”转变的育种方法，也是一个结合分子生物学、生物信息学、计算机科学、遗传学、育种学、栽培学、植物保护学、土壤学、生态学、生物统计学等多学科的系统工程。分子设计育种主要包括3个步骤[105]：①寻找目标性状基因（或生产品种的原材料），即通过遗传群体构建、多态性标记筛选、遗传连锁图谱构建、数量性状表型鉴定等研究，鉴定目标性状基因及基因关系；②寻找目标品种（或设计品种原型），即根据不同生态环境条件，利用已经鉴定出的各种重要育种性状的基因信息（染色体上基因位置、基因遗传效应、基因到性状的表达和生化途径、基因间互作、基因与背景环境互作等），模拟预测各种可能基因型的表型，从中选择符合特定育种目标的基因型品种；③寻找育种途径，即设计目标基因型品种选育途径（或制定生产品种的育种方案）。分子设计育种一提出，国内外均意识到其将会成为未来作物育种的发展方向，纷纷开始布局研究，在前期研究积累信息多的作物取得了一些进展。“全球水稻分子育种计划”项目已开始实施。美国已投资建立了4个小麦分子育种实验室。我国在水稻、大豆、小麦、油菜和植物花色等领域也启动了分子设计育种计划[106]。分子设计育种需要重要性状QTL或基因定位与克隆、基因型到性状表型控制机制、生物信息学数据库、品种预测模型及模拟工具、分子辅助育种、转基因育种、遗传群体培育与创新等研究基础做铺垫。受这些基础研究缺乏限制，分子设计育种仍面临着一些巨大挑战，基本还处于性状遗传解析、实验室建立、数据库构建、设计育种理论与技术体系建立等前期工作的准备当中。但是，随着相关支撑条件不断完善和分子生物学技术快速发展，分子设计育种必将在提高育种效率、准确性和降低育种成本方面发挥重要作用，从而成为解决传统育种瓶颈的唯一途径。

4 植物分子育种三大方向发展趋势

为更好了解研究发展趋势和最新进展，按5年为1个时间段，对1992年至2016年共25年间，植物分子辅助育种、转基因育种和分子设计育种相关研究论文数进行了统计，结果见表1。随着时间发展，该三大植物分子育种研究方向论文数均逐年增长。其中，分子辅助育种和分子设计育种研究增长迅速，尤其是分子设计育种研究，转基因育种研究则在2002—2006年大幅增长后，增幅放缓。这可能与其受到社会反转基因呼声影响有关。分子辅助育种的遗传连锁作图、QTL定位作图研究稳步发展，关联分析作图研究出现爆发式增长，分子辅助选择进展则相对缓慢；转基因育种以农杆菌介导转化研究为主，其次为基因枪介导转化研究，CRISPR/CAS基因编辑研究则因其简单易行特点被推崇也出现爆发式增长；分子设计育种的转录组测序研究因其廉价高效特点而井喷式增长，全基因组测序和蛋白组测序研究稳步增加，品种分子设计研究开始起步，并在材料平台、设计软件开发和目标品种模拟设计方面取得一些实质性进展，根据设计方案培育出了满足在UK环境下生长目标的品种[107-109]。

5 药用植物分子育种存在的问题与展望

5.1 提高药效是药用植物分子育种的主要目标 提高疗效在药材中体现为提高有效成分含量的育种研究，这是药用植物分子育种的主要目标，也是药用植物育种的基本要求。药用植物分子育种的对象只能选择有效成分明确并且以单体成分为用途的药用植物，例如开展青蒿（青蒿素）、红豆杉（紫杉醇）、银杏（银杏内酯B）、蛇足石杉（石杉碱甲）、穿心莲（穿心莲乙素）、人参（人参皂苷Rd，Rh₂，Rg₃）、罗汉果（罗汉果甜苷5、赛门苷等）等分子育种研究，对于有效成分不确定以及不以单一中药成分为生产目标的药材不能盲目开展育种工作。转录组和代謝组分析已成为次生代谢化合物合成关键酶鉴定和代谢途径解析的有效策略，如Ithin等[110]鉴定了土豆和番茄中参与甾体糖苷生物碱代谢合成的10个关键酶基因；Frusciante等[111]解析了藏红花中藏红花素生物合成第一步专属代谢途径关键酶基因；Itkin等[103]解析了罗汉果中罗汉果皂苷Ⅰ至皂苷Ⅵ完整代谢合成途径。基因编辑技术是进行基因功能鉴定和新品种培育的有力工具。采用TALEN技术，Müller等[112]通过基因靶向敲出鉴定了参与拟南芥次生代谢化合物植保素camalexin生物合成关键酶基因CYP71A12。采用CRISPR/Cas 9技术，Jiang 等[113]靶向抑制FAD2基因表达，显著增加了异源六倍体亚麻荠的油酸含量；Alagoz等[114]精确地靶向敲出药用植物罂粟生物碱代谢关键酶基因4′OMT2，使其发生1～4个碱基的InDel突变，实现对生物碱代谢途径的平衡调控，有效降低了生物碱的含量。成分含量为多基因控制的数量性状，育种难度大。有效成分明确的药用植物可将转录组、遗传转化、基因编辑和代谢组等技术有机结合，进行有效成分与毒性成分基因挖掘、功能鉴定和代谢途径解析，以及增加红豆杉、蛇足石杉等有效成分含量低药用植物药效与减少半夏、附子等有毒药用植物毒性的育种研究。种群内有效成分存在严重分离的，还可采用拟测交或BSA策略，充分发挥新一代测序技术强大分析能力，进行SLAF，GBS等简化基因组测序和遗传连锁、QTL定位、关联分析作图研究，快速鉴定与有效成分含量紧密连锁的分子标记和QTL，借助分子辅助选择技术提高良种筛选和纯种培育的效率，加快育种进程。当然，品种培育试验与生产应用过程应符合现行《农业转基因生物安全管理条例》和《农业转基因生物安全评价管理办法》要求，进行受体植物、基因操作和转基因植物及产品安全性（遗传稳定性、环境安全性、食用安全性）评价。转基因植物及产品食用安全性评价，除了规定的毒理学评价、致敏性评价、关键成分分析和全食品安全性评价外，还必须进行用药安全性评价。随着转基因技术在药用植物育种中应用的增加，是否需要制定出专门针对药材转基因应用的管理规定，应认真、慎重的讨论。

5.2 挖掘和创造优良农艺性状也是药用植物的分子育种目标 在确保中药药效的前体下，改善农艺性状也是药用植物育种的目标。种子繁育种苗混杂、产量低而种植无效益、产量低而药材价格过高、病虫多而药材农残严重是中药材产业面临的突出问题。优异农艺性状关系到药材的产量与质量，包括更高的生物产量、更好的抗病、抗虫、抗逆性状和特殊农艺性状等。这些性状均为复杂的数量性状，且药用植物种类繁多，大多数刚完成从野生到家种的转变，性状遗传规律认识不足，种质缺乏且杂合度高，还存在生长周期长与自交不亲和问题。药用植物育种仅采用系统选育和杂交选育方法进行良种选育将收效甚微，需要借助分子辅助选择等技术来提高效率和加速育种进程。半夏、三七等种群内农艺性状存在严重分离的药用植物也可采用拟测交或BSA策略，应用遗传连锁分析进行初步作图和QTL定位，再利用SLAF，GBS等简化基因组测序分析进行精细作图和QTL定位，快速获得与产量、抗病虫、抗逆、性别等性状连锁的分子标记和QTL，借助分子辅助育种技术筛选优良种质、培育纯种和开展聚合育种研究，即将各种优异性状基因和QTL逐步集中于某个单一品种是药用植物育种更高的要求。采用CRISPR/Cas 9技术，Shi等[115]靶向突变玉米乙烯反应负调控基因ARGOS8，使玉米开花期受胁迫条件下的产量每英亩增加了136.08 kg。Wang等[116]靶向突变稻瘟病侵染效应因子基因OsERF922，增强了水稻稻瘟病抗性，且农艺性状与野生型无显著差异。因此，种质严重缺乏的珍稀濒危药用植物，还可运用基因编辑技术进行种质创新和新品种的培育。

5.3 药用植物常规育种研究是分子育种的基础 强大的常规育种研究基础，能更有效、更精准的应用分子育种技术。如果没有常规育种提供的遗传群体材料和性状信息作为基础，分子育种就成为无源之水。与农作物相比，药用植物的常规育种研究基础薄弱，突出表现在种质全面收集保存、种质系统评价鉴定、性状遗传规律分析、核心种质构建、遗传材料分离纯化、种质创新等研究工作不足，以致优异突变体、高纯度品系、重组自交系、近等位基因系、回交近交群体和单片段代换系等遗传群体材料缺乏。因此，必须加强这些周期长、基础薄弱的常规育种研究的持续积累。

5.4 充分利用最新分子生物學技术为分子育种服务 新品种培育如何确保药材疗效是中药领域广泛关注的问题，也是药用植物育种面临的巨大挑战。分子设计育种是一种综合了多学科、多层次信息的高效、精准、预见性强的育种技术。除了目标性状发生变异外，其他性状保持不变是分子设计育种要达到的目标。因此，分子设计育种可很好适应药用植物新品种培育过程中确保药材疗效的要求。全基因组测序、控制性状QTL或基因的定位与克隆鉴定、基因型到性状表型控制机制、基因与环境互作效应、分子辅助选择技术、基因组编辑技术、种质资源培育与创新等研究是分子设计育种的必要基础。药用植物虽然在遗传图谱构建、基因组测序、次生代谢产物基因挖掘与鉴定、种质收集评价等方面取得了一定进展，但是分子设计育种这些相关基础研究积累仍相当薄弱。因此，应选择如丹参、灵芝等已完成基因组测序、前期研究积累相对较多的药用植物，制定中长期育种科研规划，借助基因组、转录组、蛋白组、翻译组、小RNA组、表观遗传组、基因转导、基因编辑、合成生物学等日新月异的分子生物学技术和信息技术，尽快建立药用植物分子设计育种技术体系，相信这些新技术的应用必将为药用植物种质创新带来重大突破。

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[责任编辑 吕冬梅]