甲基磺酸乙酯诱变瓠瓜种子的条件筛选

康保珊，李俊香，刘丽锋，古勤生

（中国农业科学院郑州果树研究所郑州450009）

甲基磺酸乙酯诱变瓠瓜种子的条件筛选

康保珊，李俊香，刘丽锋，古勤生

（中国农业科学院郑州果树研究所郑州450009）

为构建瓠瓜突变体库，以瓠瓜材料‘安生葫芦’种子为试材，探索甲基磺酸乙酯（EMS）诱变的最佳条件。设置种子开壳和不开壳2种处理，0.8%、1%、1.5%、2%、3%和4.5%共6个不同EMS浓度，2、4、8、12 h共4个不同诱变时间，分析24个不同浓度和时间处理组合对开壳种子相对发芽率的影响。结果表明，种子开壳处理后对EMS诱变浓度的敏感性显著提高。在相同EMS浓度下，诱变时间越长瓠瓜种子相对发芽率越低，8 h为最佳诱变时间；在相同EMS诱变时间下，EMS浓度越大相对发芽率越低；随着EMS诱变时间的增加，不同EMS浓度间种子发芽率的差异显著性降低，半致死浓度为1%～2%。综合分析，确定EMS诱变最佳条件为：瓠瓜种子开壳后温水浸种4 h，然后用1.5%EMS诱变处理8 h。

瓠瓜；种子；甲基磺酸乙酯；诱变

葫芦科葫芦属的瓠瓜（Lagenaria sicerariavar. hispida）又名瓠子，广泛用作西瓜甜瓜砧木以防枯萎病。然而近年来，黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）的发生日趋严重，该病毒可侵染葫芦科作物并使其种子带毒传播［1-3］，给我国西瓜甜瓜生产造成了严重的威胁。已有研究表明，自然条件下西瓜种子很少带毒，甚至不带毒［4］，而该病毒主要通过砧木种子带毒传播，西瓜大量采用嫁接栽培的生产方式时很容易被侵染。瓠瓜砧木是CGMMV的易感作物，种子携带CGMMV非常普遍［5-7］，导致生产上大量采用南瓜代替瓠瓜作为西瓜砧木，但以瓠瓜作为砧木所生产的西瓜甜度和口感等品质更好，有着南瓜砧木不可替代的优点［8-12］，因此，培育抗病瓠瓜砧木对于西瓜甜瓜的生产有重要意义。目前，由于抗病种质资源缺乏，利用诱变技术创制新的育种材料是快速有效的方法。

甲基磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate，EMS）是一种常用的化学诱变剂，能诱发产生高密度的系列等位基因点突变。甜瓜是最早利用EMS诱变成功构建突变体库的葫芦科作物［13-14］，近年黄瓜和西瓜的EMS突变体库也有研究报道［15-17］。瓠瓜是西瓜甜瓜主要的砧木资源，采用EMS突变技术创造瓠瓜优异基因资源对于西瓜甜瓜的生产具有极其重要的意义。笔者通过对EMS处理浓度、时间等因素设计处理组合，筛选出诱变瓠瓜种子的最佳处理条件，为构建高质量瓠瓜突变体库、创制抗病毒病瓠瓜资源奠定基础。

1 材料和方法

1.1材料

供试瓠瓜材料‘安生葫芦’由安徽省安生种业有限公司提供。化学诱变剂为EMS，用pH 7.0的0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液配制。

1.2方法

设计2种诱变前种子处理方式：开壳后温水浸种4 h和不开壳浸种20 h，用1%的EMS诱变12 h，同时将磷酸盐缓冲液浸种设为对照，3个重复，统计发芽率。种子开壳方法：利用工具（如指甲刀）轻压种壳，使其裂缝即可。

选择最佳种子处理方式，采用2因素完全随机区组设计；因素1为EMS浓度，设6个EMS浓度水平，即0.8%、1%、1.5%、2%、3%、4.5%；因素2为诱变时间，设4个诱变时间水平，即2、4、8、12 h。共24个处理，3次重复，每个处理50粒种子。诱变结束，溶液中加入浓度0.1 mol·L-1的Na2S2O3中止反应，再用清水洗4～5次，沥干水，用湿润的纱布包好置于28℃恒温箱中催芽，为免长菌，期间需每天用清水冲洗种子表面，10 d后调查发芽率。

为排除其他因素对种子发芽率的影响，同时设pH 7.0的0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲处理作为对照（CK），按照下面公式计算发芽率：相对发芽率/%=处理的实际发芽率/对应CK实际发芽率×100。

2 结果与分析

2.1不同种子处理方式对瓠瓜种子发芽率的影响

种子采用2种方式处理：开壳和不开壳，开壳种子在EMS诱变前先用温水浸泡4 h，不开壳种子浸泡20 h。结果显示，不开壳种子在1%EMS下诱变12 h，相对发芽率为99.2%，与对照相比，没有显著差异，在此条件下开壳后的种子相对发芽率降低到46%左右（图1），与对照差异显著，表明开壳后种子对EMS诱变浓度的敏感性增加。在保证半致死率的情况下，开壳处理可以降低EMS用量，减轻环境污染，因此本试验采用开壳后温水浸泡4 h的种子处理方式。

图1种子处理方式对相对发芽率的影响

2.2开壳处理后诱变时间和EMS浓度对瓠瓜种子发芽率的影响

2.2.1诱变时间对瓠瓜种子发芽率的影响本研究中对照（CK）的实际发芽率随处理时间的增加表现为先升高后降低的趋势（表1），在8 h时达到发芽率最高，为90.67%，说明种子的发芽率受浸种时间的影响较大。因此，为排除类似因素的干扰，真实地反映EMS的影响，本试验采用50%的相对发芽率作为半致死剂量的评价指标。

表1同一浓度下不同诱变时间对瓠瓜种子发芽率的影响

当浓度小于1.5%时，诱导2 h和4 h的相对发芽率与对照差异不明显；浓度为2%时，诱导4 h、8 h 和12 h的相对发芽率与对照差异明显；EMS浓度≥3%时，4个诱导时间的相对发芽率与对照都有明显差异，表明浓度和时间都会影响种子的相对发芽率，浓度一定，诱变时间增加，种子的相对发芽率降低。本试验中，在所有EMS浓度下，4 h和8 h处理间差异显著，而8 h和12 h间差异不显著，表明浓度不变，诱变时间增加到8 h后，种子相对发芽率趋于稳定。本研究中，相对发芽率为40%～50%的诱变时间几乎都是8 h和12 h，为提高实际发芽率，选择8 h作为最佳诱变时间。

2.2.2EMS浓度对瓠瓜种子发芽率的影响图1表明，诱变时间为2 h，0.8%、1%和1.5%浓度的EMS处理后种子相对发芽率分别为117.46%、115.99%、106.67%，明显高于对照，表明低浓度EMS短时间诱变后可适当提高种子发芽率；随着EMS浓度的增加，种子相对发芽率逐渐降低，EMS浓度达到4.5%诱变12 h时，相对发芽率仍可达到15.65%，说明本试验所用瓠瓜种子对EMS有较高的耐受性。诱变时间为4 h，2%、3%、4.5%浓度的EMS处理后种子相对发芽率与对照差异显著，相对发芽率分别为79.44%、54.27%、34.35%；诱变时间为8 h，所有浓度处理都与对照差异显著，但1%～3%浓度的EMS处理间的差异不显著，相对发芽率在45%左右；诱变时间为12 h，所有浓度处理都与对照差异显著，浓度在0.8%～3%各处理之间的差异不显著，相对发芽率在45%左右。上述结果显示，在同一EMS诱变浓度处理下，诱变时间增加，种子发芽率显著降低，但随着诱变时间的增加，瓠瓜种子对EMS浓度变化敏感度下降，因此在致死率基本稳定的情况下，可以适当增加EMS浓度以提高后代的变异率。

2.2.3筛选种子半致死剂量的最佳处理组合本研究中开壳的24个浓度/时间处理组合中，有8个处理组合的相对发芽率都在44%～54%，分别为：0.8%-12 h，1%-12 h，1.5%-12 h，2%-12 h，1%-8 h，1.5%-8 h，2%-8 h，3%-4 h。表明1%～2%浓度的EMS为瓠瓜诱变的适宜浓度，在此浓度范围内，诱变8～12 h可达到半致死剂量，提高浓度需要相应缩短诱变时间。综合分析认为，8 h为最佳诱变时间。因此，为保证后代的变异率和存活率，本研究选择种子开壳后温水浸种4 h后，采用浓度为1.5% 的EMS诱变处理8 h为最佳诱变条件。

图1相同时间不同EMS浓度对瓠瓜种子发芽率的影响

3 讨论

确定适宜的EMS浓度和诱变时间是化学诱变中获得最佳突变频率、提高变异率、得到理想突变体的关键。通常情况以半致死浓度作为标准，一般以50%的种子发芽率作为半致死浓度的指标。处理浓度和时间是影响种子发芽率的主要因素，为避免其他因素干扰，本试验将相对发芽率作为确定半致死浓度的依据。EMS最佳浓度与材料自身的性质直接相关，小麦、水稻、番茄等作物成功构建突变体库的诱变浓度都在1%左右［18-21］，拟南芥这种株型小、种子小的植物诱变浓度较低，构建拟南芥突变体库的适宜浓度是0.25%～0.5%［22-23］。水稻和小麦都有较硬的外壳，且水分渗透需要较长的时间，所以需要的诱变浓度相对较高，而拟南芥种皮较薄，几乎不能阻止水分的渗透，所以需要的浓度相对较低。瓠瓜种子大，种壳厚，浸种20 h后，1%的EMS诱变12 h相对发芽率与对照没有显著差异，而开壳后再进行诱变处理，1%的EMS诱变12 h相对发芽率已经降到46%左右。王学征等［16］在诱变西瓜时也采用了种子开壳的方式，确定EMS处理浓度1.0%、诱变时间9 h为最佳诱变条件。本研究发现，EMS处理浓度在一定范围内变化时，相对发芽率差异不显著，表明瓠瓜种子对EMS诱变的敏感度较低，在此浓度范围内选择较高浓度处理会增加突变频率和变异率。葫芦科作物中，甜瓜种子同样表现出对EMS的低敏感性，在1%～3%的EMS处理浓度范围内发芽率都在97%以上［24］。黄瓜对EMS的敏感性可能存在品种差异，如黄瓜‘Poinsett76’在2.5%的浓度下，发芽率保持在85%左右［15］，而‘Be⁃it Alpha’在0.75%的浓度下，发芽率已经降低到40%［25］。王军伟等［26］研究证实不同品种烤烟对EMS的诱变敏感性不同。可见，基因差异也可影响突变效率和突变频率。

通常瓠瓜开壳后浸种催芽种子发芽率会降低，多数研究结果显示，EMS处理会影响种子的萌发，但本研究中低浓度、短时间的诱变可以适当增加开壳瓠瓜种子的发芽率。早在1989年，李学宝和杨学荣［27］就报道低浓度的EMS对水稻种子的发芽势及幼苗的生长发育有促进作用，进一步研究证实，低剂量的EMS可以刺激呼吸，提高细胞色素氧化酶和α-淀粉酶活性，从而促进种子萌发和幼苗生长［28-29］。霍雅馨等［30］对箭筈豌豆的研究中也证实短时间的EMS处理可以促进幼苗的生长。相反，高剂量的EMS会对细胞造成严重的生理损伤,且这种损伤在短期内不能完全修复，植株后期的生长发育会受到抑制。因此，在半致死剂量范围内选择低浓度、短时间EMS处理可以提高植株存活率，保证有更多的突变遗传给后代。

突变体库的建立可以为瓠瓜的新品种选育提供丰富的突变资源，推进瓠瓜重要性状基因的研究。EMS诱变条件的确定是构建突变体库的第一步，目前EMS对瓠瓜后代的诱变效应以及突变体的筛选还处于探索研究阶段，以50%的发芽率为指标确定诱变浓度能否获得满意的变异率还有待进一步的试验证明。

4 结论

开壳处理可以显著提高瓠瓜种子对EMS的敏感性，相对发芽率由不开壳的99%降低到46%；低浓度EMS短时间处理开壳后的种子可明显提高种子发芽率；随着EMS处理浓度和时间的增加，相对发芽率降低，同一浓度，诱变时间达到8 h后，继续诱变导致相对发芽率变化趋缓；随着诱变时间的增加，不同浓度间差异显著性降低。综合分析，笔者认为瓠瓜种子最佳EMS诱变条件为：开壳后温水浸种4 h进行EMS诱变，半致死浓度为1%～2%，处理时间为8 h。

[1]KIM D H，LEE J M．Seed treatment for cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）in gourd（Lagenaria siceraria）seeds and its detection[J]．Journal of the Korean Society for Horticultural Science，2000，41（1）：1-6．

[2]CHOI G S．Occurrence of two tobamovirus diseases in cucurbits and control measures in Korea[J]．The Plant Pathology Journal，2001，17（5）：243-248．

[3]LI J X，LIU S S，GU Q S．Transmission efficiency of cucumber green mottle mosaic virus via seeds，soil，pruning and irriga⁃tion water[J]．Journal of Phytopathology，2016，164（5）：300-309．

[4]蔡明，江冬，张丽英，等．黄瓜绿斑驳花叶病毒种子处理试验研究[J]．植物检疫，2011，25（1）：62-63.

[5]秦碧霞，蔡健和，陆秀红，等．葫芦种子传黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测[J]．植物保护，2011，37（3）：109-112.

[6]吴会杰，秦碧霞，陈红运，等．黄瓜绿斑驳花叶病毒西瓜、甜瓜种子的带毒率和传毒率[J].中国农业科学，2011，44（7）：1527-1532.

[7]宋顺华，吴萍，宫国义，等．黄瓜绿斑驳花叶病毒在葫芦上的种传规律及热处理效果评价[J]．植物保护学报，2015，42（5）：841-847.

[8]关立颖，刘文革，裴孝伯，等．不同砧木对西瓜果实中糖和Vc含量的影响[J]．西北农业学报，2012，21（1）：136-140.

[9]马双武，尚建立，王吉明．西瓜嫁接砧木资源的初步筛选研究[J]．中国瓜菜，2012，25（4）：39-42.

[10]房超，李跃建，刘小俊，等．不同砧木品种对嫁接西瓜生长、产量和品质的影响[J]．长江蔬菜，2009（2）：27-28.

[11]ALAN O，OZDEMIR N，GUNEN Y．Effect of grafting on watermel⁃on plant growth，yield and quality[J]．Journal of Agronomy，2007，6（2）：362-365.

[12]韩志平，郭世荣，朱国荣，等．砧木对嫁接西瓜生长发育、产量和品质的影响[J]．中国蔬菜，2006（2）：22-23.

[13]TADMOR Y,KATZIR N,MEIR A,et al.Induced mutagenesis to augment the natural genetic variability of melon（Cucumis meloL.）[J]．Israel Journal of Plant Sciences，2007，55（2）：159-169.

[14]GONZÁLEZ M，XU M，ESTERAS C，et al．Towards a TILLING platform for functional genomics in Piel de Sapo melons[J]．BMC Research Notes，2011，4：289.

[15]FRAENKEL R，KOVALSKI I，TROADEC C，et al．Development and evaluation of a cucumber TILLING population[J]．BMC Research Notes，2014，7：846.

[16]王学征，朱娜娜，高清宇，等．EMS诱变西瓜种子条件分析[J]．东北农业大学学报，2015，46（7）：35-39.

[17]张兵．EMS诱导黄瓜突变体的初步研究[D]．山东：山东农业大学，2012.

[18]Liu S,Gao H,Wu X,et al.Isolation and characterization of an aluminum-resistant mutant in rice[J].Rice(N Y)，2016，9(1)：60.

[19]LAUDENCIA CHINGCUANCO D．Isolation and characterization of EMS inducedDy10andAx1high molecular weight glutenin subunit deficient mutant lines of elite hexaploid wheat（Triticum aestivumL.）cv.Summit[J]．Journal of Cereal Science，2012，56 （2）：296-299.

[20]WATANABE S，MIZOGUCHI T，AOKI K，et al．Ethylmethane⁃sullfonate（EMS）mutagenesis ofSolanum lycopersicumcv．Micro-Tom for large-scale mutant screens[J]．Plant Biotechnolo⁃gy，2007，24（1）：33-38.

[21]崔霞，梁燕，王玲慧．不同浓度化学诱变剂甲基磺酸乙酯对番茄种子发芽的影响[J]．北方园艺，2013（14）：28-30.

[22]HIRANO T，KAZAMA Y，OHBU S，et al．Molecular nature of mutations induced by high-LET irradiation with argon and carbon ions inArabidopsis thaliana[J]．Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，2012，735（1/2）：19-31.

[23]GREENE E A，CODOMO C A，TAYLOR N E，et al．Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen inarabidopsis[J].Genetics，2003，164（2）：731-740.

[24]DAHMANI MARDAS F，TROADEC C，BOUALEM A，et al．Engineering melon plants with improved fruit shelf life using the TILLING approach[J]．PLoS One，2010，5（12）：e15776.

[25]BOUALEM A，FLEURIER S，TROADEC C，et al．Development of aCucumis sativusTILLinG platform for forward and reverse genetics[J]．PLoS One，2014，9（5）：e97963.

[26]王军伟，蒋彩虹，宋志美，等．甲基磺酸乙酯对烤烟种子发芽率的处理效应[J]．中国烟草科学，2011，32（3）：17-21.

[27]李学宝，杨学荣．EMS对水稻种子萌发生长初期的影响[J]．湖北农业科学,1989（2）：4-6.

[28]李学宝．甲基磺酸乙酯对水稻萌发种子的生理效应[J]．武汉植物学研究，1991，9（3）：263-267.

[29]李学宝．甲基磺酸乙酯（EMS）对水稻离体幼穗影响的初步研究[J]．武汉植物学研究，1989，7（1）：65-70.

[30]霍雅馨，王娜，张吉宇，等．3种诱变因子对箭筈豌豆种子萌发的影响[J]．草业科学，2014，31（3）：438-445.

·书讯·

《甜瓜种质资源描述规范和数据标准》由中国农业科学院郑州果树研究所主持编写，并得到了全国甜瓜科研、教学和生产单位的大力支持。甜瓜种质资源描述规范和数据标准的制定是国家农作物种质资源平台建设的重要内容，共分三大部分，其中甜瓜种质资源描述规范规定了甜瓜种质资源的描述符及其分级标准，以便对甜瓜种质资源进行标准化整理和数字化表达。甜瓜种质资源数据标准规定了甜瓜种质资源各描述符的字段名称、类型、长度、小数位、代码等，以便建立统一的、规范的甜瓜种质资源数据库。甜瓜种质资源数据质量控制规范规定了甜瓜种质资源数据采集全过程中的质量控制内容和质量控制方法，以保证数据的系统性、可比性和可靠性。

邮购价:32元(含挂号费)；邮购地址：郑州市未来路南端中国农业科学院郑州果树研究所；收款人：杂志社；电话：0371-65330982/1。

Screening optimal condition of mutagenesis with EMS for bottle gourd (Lagenaria siceraria)seed

KANG Baoshan,LI Junxiang,LIU Lifeng,GU Qinsheng
(Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450009,Henan,China)

The mutagenesis study was carried out with the bottle gourd seeds of‘Ansheng’in order to construct gourd mutant population.To screen the optimal condition of ethyl methanesulfonate(EMS),we analyzed the effect of the method of treatment for seed coat,the concentration and treatment time of EMS on seed germination rate.It was found the sensitivity to EMS was improved significantly when seed coat was opened.Therefore,under the condition of opening coat,we set up six different concentrations of EMS(0.8%,1%,1.5%,2%,3%and 4.5%)and four different induced times(2,4,8 and 12 h)to analyze the seed relative germination in 24 different combinations of concentration and time.The results showed that the relative germination rate was reduced when the inducing time increased at the same concentration.But exceeding over 8 h, the effect was significant.In the same time,the relative germination rate was reduced with increasing EMS concentration.In this study,the optimum treatment with EMS mutagenesis was that the coat opened gourd seeds are soaked in warm water for 4 h,then treated with 1.5%of EMS for 8 h,the median lethal concentration was 1%-2%.

Lagenaria siceraria var.hispida;Seed;EMS;Mutagenesis

2016-09-14；

：2016-12-20

河南省基础与前沿技术研究计划项目（152300410232）；国家现代产业技术体系病毒病害防控岗位(CARS-26-13)；中央级科研院所基本科研业务费专项（1610192017704）

康保珊，女，副研究员，主要研究方向为植物抗病性遗传学。E-mail:kangbaoshan@caas.cn

古勤生，男，研究员，主要研究方向为植物病理学。E-mail:guqinsheng@caas.cn