多功能植物根际促生菌 DD3 的功能特性及对大蒜幼苗的促生效果

张梦琦，陈云云，张熙，邓辉，孙建光，高淼*，卜宁*

多功能植物根际促生菌 DD3 的功能特性及对大蒜幼苗的促生效果

张梦琦1，陈云云2，张熙2，邓辉2，孙建光2，高淼2*，卜宁1*

（1 沈阳师范大学生命科学学院，辽宁沈阳 110034；2 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业部农业微生物资源收集与保藏重点实验室，北京 100081）

【目的】植物根际促生菌 (plant growth promoting rhizobacteria, PGPR) 能够促进植物生长、防治病害、增加作物产量，具有较好的环境兼容性、不易引起抗性、效果持久稳定等优势。筛选高效多功能菌，探索抗病促生机理，对开发防控大蒜土传病害的微生物技术，发展“高产、优质、高效、生态、安全”的大蒜产业具有十分重要的理论和现实意义。 【方法】以实验室前期从山东省金乡县连作大蒜根部分离的 70 株细菌为供试菌株，筛选对大蒜根腐病病原真菌拟枝孢镰刀菌 (Fusarium sporotrichioides) ACCC37402 和大蒜叶枯病病原真菌链格孢属菌株 (Alternaria sp.) D14011-1 具有较好拮抗效果的菌株；采用 16S rDNA 基因序列同源性分析，对其进行初步鉴定；通过测定菌株对抗生素的敏感性、水解蛋白能力、产铁载体能力、产 HCN 能力等，研究菌株的拮抗特性；通过测定菌株的固氮能力、溶磷能力、产 IAA 能力，产 ACC 脱氨酶能力等，研究菌株的促生特性；通过温室盆栽试验，进行多功能菌菌悬液及其无菌发酵液对大蒜幼苗生长的影响以及抗病效果研究。 【结果】菌株 DD3 对大蒜根腐病病原真菌 ACCC37402 和大蒜叶枯病病原真菌 D14011-1 具有较好拮抗效果，抑菌率均为45%；经 16S rDNA 基因序列同源性分析，初步确定为芽孢杆菌属 (Bacillus) 菌株。其它功能特性研究结果显示：菌株 Bacillus sp. DD3 具有水解蛋白能力、产 HCN 能力、产铁载体能力、固氮能力、溶解有机磷和无机磷的能力；对氨苄青霉素钠、硫酸卡那霉素等 11 种抗生素无耐受性，不具有分泌吲哚乙酸 IAA 能力和产 ACC 脱氨酶能力。盆栽试验显示，接种 Bacillus sp. DD3 菌悬液对大蒜根腐病的防治效果较好，防控率达 80%。接种Bacillus sp. DD3 及其无菌发酵液后能够促进大蒜幼苗的生长，其中接种菌悬液效果更佳。 【结论】菌株Bacillus sp. DD3 兼具多种功能特性，对大蒜根腐病具有较好的拮抗效果，同时可以显著促进大蒜幼苗生长，有望进一步研究开发成为微生物肥料生产菌种。

大蒜；植物根际促生菌 (PGPR)；多功能菌；抗病；促生

大蒜 (Allium sativum L.) 属于百合科葱属，含有丰富的营养物质，是深受世界各国人民喜爱的保健蔬菜，又是重要的调味品和医药原料[1–2]。随着大蒜市场需求量的不断攀升，农民为追逐经济效益，主产区的连作现象日益严重，导致在正常管理下大蒜生长弱、病害频发、土壤板结、有效养分含量下降等连作障碍问题，严重影响大蒜的产量和品质，已成为制约大蒜生产可持续发展亟待解决的重要问题[3–6]。大量研究表明，某些植物根际促生菌 (PGPR) 不仅能够产生多种抗生素和嗜铁素、蛋白酶等与拮抗相关的次级代谢产物，有效地抑制土传病害[7–9]；同时某些拮抗菌具有固氮、溶磷、产 ACC 脱氨酶、产 IAA等功能特性，可以促进植物生长、改善土壤的微生态环境[10–11]。如果将这些拮抗菌在连作大蒜土壤中使用，必将有效缓解、克服大蒜连作导致的植物生长势弱、病害严重等问题，提高大蒜产量。因此，筛选多功能拮抗菌，探索抗病促生机理，研制防控大蒜土传病害的微生物肥料，对发展“高产、优质、高效、生态、安全”的大蒜产业具有十分重要的理论和现实意义。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试细菌 70 株，为实验室前期从山东省金乡县连作大蒜根部分离保藏的微生物资源。大蒜根腐病病原真菌拟枝孢镰刀菌 (Fusarium sporotrichioides) ACCC37402 和大蒜叶枯病病原真菌链格孢属菌株(Alternaria sp.) D14011-1 由中国农业微生物菌种保藏管理中心 (Agriculture Culture Collection of China, ACCC) 提供。供试土壤采集自山东省金乡县马庙镇卓庙村张庄连作大蒜 20 年以上的土壤。

1.2 培养基

PDA 培养基：葡萄糖 20 g，马铃薯 200 g，蒸馏水 1000 mL，琼脂 15～20 g，pH 自然。

牛肉膏培养基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 15～20 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0。

King’s B培养基：甘油 10 mL，蛋白胨 20.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO41.5 g，1.8% 琼脂，pH 7.2。

蛋白酶检测培养基：蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，CaCl20.1 g，脱脂奶粉 10.0 g，1.8% 琼脂，115℃ 灭菌 30 min，pH 7.2～7.4。

有机磷卵黄培养基：NaCl 5.0 g，牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7～7.5 (临用时每 50 mL 中加入新鲜蛋黄液 3 mL，蛋黄液按无菌生理盐水与鸡蛋黄 1∶1 配置)。

无机磷培养基：KCl 0.2 g，NaCl 0.2 g，(NH4)2SO40.5 g，Ca3(PO4)25.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.02 g，葡萄糖10.0 g，蒸馏水 1000 mL，琼脂 20.0 g，pH 7～7.5。

无氮培养基[12]：K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 0.12 g，CaCO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，琼脂 20.0 g。

DF培养基：KH2PO44.0 g，Na2HPO46.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，(NH4)2SO42.0 g，葡萄糖 2.0 g，葡萄糖酸钠 2.0 g，柠檬酸 2.0 g，组分一、组分二溶液各 0.1 mL，蒸馏水 1000 mL，pH 7.2。组分一：MnSO4·H2O 11.19 mg，CuSO4·5H2O 78.22 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，H3BO310.0 mg，MoO310.0 mg溶于 100 mL 无菌水中。组分二：FeSO4·7H2O 100.0 mg溶于 10 mL 无菌水中。

ADF 培养基：ACC 溶于去离子水后过滤灭菌，加到不含 (NH4)2SO4且灭好菌的 DF 培养基中，ACC终浓度为 3.0 mmol/L。

1.3 两点对峙实验方案

利用两点对峙法，测定菌株对病原真菌的拮抗能力[13]。选用 PDA 平板，在距离平板中心 2 cm 的位置做上两点圆点标记，将大蒜土传根腐病病原真菌ACCC37402 和大蒜叶枯病病原真菌 D14011-1 分别准确接在其中一点上，并将取 2 μL 待测菌液点于另一圆点，设置 3 个重复。在培养箱里面 28℃ 培养 7 d后，观察实验结果，拍照记录实验数据，测定其抑菌半径。抑菌直径和抑菌率计算：

抑菌直径 = 对照病原真菌直径 – 与拮抗菌对峙的病原真菌直径

抑菌率 = (对照病原真菌直径 – 与拮抗菌对峙的病原真菌直径)/对照病原真菌直径 × 100%

1.4 菌株16S rDNA序列测定与系统发育分析

挑取少量单菌落，放入盛有 100 μL 无菌水的 EP管中，95℃ 加热 15 min 后迅速放入 –20℃ 冰箱1 min，12000 r/min 离心 2 min，4℃ 保存，用时取上清液为模板[14]。

PCR 扩增 16Sr DNA 序列，引物采用 16S rDNA的通用引物，DNA 片段大小约 1500 bp，由上海生工合成。引物 1 (27f)，5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′；引物 2 (1492r)，5′-TACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3′。PCR 扩增反应体系[15]：2 × mixTaq (购自 TaKaRa 公司) 25 μL，引物 (10 μmol/L) 1 μL，模板 2 μL，用去离子水补足到 50 μL 体系。反应程序：95℃ 预变性 5 min、95℃ 变性 1 min、55℃ 退火1 min、72℃ 延伸 2 min，35 个循环，最后 72℃ 再延伸 10 min，4℃ 保存。

PCR 产物用含有 0.5 μg/mL 溴化乙锭的 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，取 4 μL 的扩增产物和 1 μL loading buffer 混匀上样，200 V，电泳 15 min，于凝胶成像系统中观察并拍照，送北京生工有限责任公司测序。获得序列在EzTaxon数据库上进行序列在线比对，采用Mega软件进行系统发育分析。

1.5 菌株拮抗特性测定项目及方法

1.5.1 抗生素敏感性能力检测 采用抑制菌圈法测定拮抗菌对抗生素敏感性[16]。将拮抗菌培养液均匀地涂布于 NA 平板表面，同时以无菌镊子夹取含氨节青霉素钠、链霉素、盐酸四环素等 11 种常见抗生素的纸片 (纸片含量 10 μL/纸片) 置于含菌平板上，30℃培养 48 h 后，取出观察测定抑菌圈的大小。

1.5.2 产蛋白酶能力检测 采用透明圈法测定[17]。将待测菌株接种于蛋白酶检测培养基，置于 30℃ 培养2 d。观察菌落周围透明圈大小可判断菌株的蛋白质水解能力。

1.5.3 产 HCN 能力检测 King’s B培养基中加入 4.4 g/L的甘氨酸，将拮抗菌培养液均匀地涂布于 King’s B培养基中，用无菌镊子夹取浸入过 0.05% 苦味酸 (三硝基苯酚) 和 2% Na2CO3混合溶液的滤纸，置于培养皿中间，平皿四周用封口膜封住防止漏气。置于30℃ 培养 2 天。HCN 与苦味酸在 Na2CO3存在下颜色发生变化，依次呈现深黄、橘色、橘棕、深棕，由此可判断 HCN 的产生[18]。

1.5.4 产铁载体能力检测 菌株产铁载体能力定性测定参考 Schwyn 等蓝色定性检测培养基[19]。然后按每皿 30 mL 倾注于培养皿 (Φ 90 mm) 中，以在 CAS 检测平板上出现橘黄色晕圈的菌株为供试菌株，定性为产铁载体阳性菌。

1.6 菌株促生特性测定项目及方法

1.6.1 溶磷能力测定 采用平板筛选法测定溶磷能力[20]。活化供试菌株，制成菌悬液，分别取 2 μL 点接于有机磷和无机磷培养基平板上，无机磷源为Ca3(PO4)2，有机磷源为新鲜蛋黄液，每各处理三个重复，28℃ 培养 14 天。观察菌株周围能否形成透明圈，判断其是否具有溶磷能力。

1.6.2 固氮能力测定 将待测菌株分别接种于无氮平板上，再从无氮平板上挑取菌落在新的无氮平板上划线，28℃ 培养，在第 3 天目测其生长状况，平板上有菌落的为阳性。筛选有固氮能力的细菌进行固氮酶活性测定。

采用乙炔还原法[15]测定菌株固氮酶活性。15 mm × 150 mm 螺口试管中加入 5 mL 无氮培养基制成斜面，接种固氮菌。28℃ 培养 72 h 后换橡胶塞，注入乙炔气体至终浓度为 10%，继续培养 72 h。取 100 μL反应气体，气相色谱仪测定乙烯生成量；菌体蛋白量测定用 5 mL 生理盐水洗涤、收集上述固氮酶测定后的斜面菌体，加入 3 mL 0.5 mol/L NaOH 煮沸 5 min，加入 3 mL 0.5 mol/L HCl，离心，取上清 1.0 mL 加入5 mL 考马斯亮蓝，混合、显色 3 min，测定 595 nm处的吸光值。根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白量。固氮酶活性 [nmol/(mg·h), protein] = C2H4(nmol)/[菌体蛋白量 (mg, protein) × 反应时间 (h)]。

1.6.3 IAA 能力测定 采用比色法测定菌株产 IAA 的能力[21]。菌株在 DF 培养基中过夜生长，然后转移到含 0.1% L-色氨酸的 DF 培养基中。菌株在 28℃ 条件下培养 7 天，然后 8000 r/min 离心 10 分钟。1 mL 的悬浮液混合 2 mL 的 Fe-H2SO4溶液 (取 1 mL 的 0.5 mol/L FeCl3·6H2O 溶液到 74 mL 的 6.13 mol/L H2SO4中) 暗室放置 45 min，IAA 浓度计算通过测量样品和标准品的吸光度在 450 nm 处的标准曲线。

1.6.4 ACC 脱氨酶活性菌株的筛选 参考 Glick 的方法[22]，将菌种接入 5 mL 固氮液体培养基，28℃ 200 r/min 振荡培养 24 h，吸取 0.1 mL 悬浮液至 5 mL 的DF 培养基中，同条件继续培养 24 h，吸取 0.1 mL悬浮液至 5 mL 的 ADF 培养基中，同条件继续培养24～48 h。将可在 ADF 培养基中生长的菌种再转接一次，用不含 ACC 的 ADF 培养基为阴性对照。分别以不接菌的 ADF 和不含 ACC 的 ADF 培养基调零，测定 600 nm 处菌液的吸光度值，确定 ACC 脱氨酶的阳性菌株。

1.7 温室条件下多功能菌 Bacillus sp. DD3 (DD3)对大蒜根腐病 ACCC37402 的抗病能力试验设计

处理分别为接种大蒜根腐病原真菌 ACCC37402的孢子液 (后简称 37402)、37402 + DD3 菌悬液、37402 + DD3 的无菌发酵液，对照为不接菌。将大蒜根腐病病原真菌 ACCC37402 接到 PDA 液体培养基中，28℃、150 r/min 培养 7 d，用血球计数板计算孢子数量，用无菌水配制成浓度为 2 × 107cfu/mL 的孢子液；将 DD3 接到牛肉膏培养基中，28℃、160 r/min培养 2 d，用无菌水配制为 OD600= 1、有效活菌数为1.8 × 106cfu/mL 菌悬液。

将肥料与灭菌土壤搅拌均匀后装到花盆中，浇透水备用。将大蒜剥皮后在水中浸泡一夜沥干放入4℃ 冰箱内 12 小时拿出。选取重量、蒜高基本一致的蒜种播种于花盆中，每个花盆种 5 个蒜瓣 (如果出苗不好，后期需要补苗)，处理和对照各 2 盆。待大蒜苗高约 5 cm 时，每株大蒜处理 1 为接 10 mL 根腐病病原真菌 37402 + 10 mL 清水，处理 2 为接 10 mL根腐病病原真菌 37402 + DD3 菌悬液 10 mL，处理 3 为接 10 mL 根腐病病原真菌 37402 + 无菌发酵液 10 mL，对照加 20 mL 清水。40 d 后，观察大蒜的感病和抗病情况，根据张博的方法[23]确定根腐病原菌的致病力，测定大蒜株高、茎粗、株鲜重、株干重，分析DD3 以及其无菌发酵液对感病大蒜幼苗生长的影响。根据大蒜植株茎基部与根部发病情况，统计发病率与防治效果[23]。防治效果 = (对照组发病株数 –防治组发病株数)/对照组发病株数 × 100%

1.8 温室条件下菌株 DD3 对大蒜幼苗的促生能力试验设计

处理为接种 OD600= 1、有效活菌数为 1.8 × 106cfu/mL 的 DD3 菌悬液、DD3 无菌发酵液，对照为不接菌。将菌株 DD3 接到牛肉膏培养基中，28℃、160 r/min 下培养 2 d。

将肥料与灭菌土壤搅拌均匀后装到花盆中，浇透水备用。将大蒜剥皮后在水中浸泡一夜沥干放入4℃ 冰箱内 12 h 拿出。选取重量、蒜高基本一致的蒜种播种于花盆中，每个花盆种 2 个蒜瓣 (如果出苗不好，后期需要补苗)，处理和对照各 5 盆。待大蒜苗高约 5 cm 时，每株大蒜接 DD3 菌悬液 10 mL、无菌发酵液 10 mL，对照处理加 10 mL 清水。40 d后，观察大蒜的长势，测定大蒜株高、茎粗、株鲜重、株干重，分析多功能菌 DD3 及其无菌发酵液对大蒜幼苗生长的影响。

1.9 数据处理

单因素方差分析采用 SPSS16.0 对数据进行方差齐性检验 (F > 0.05)，处理间多重比较采用 LSD 法。

2 结果与分析

2.1 大蒜根腐病和叶枯病拮抗菌的筛选

以实验室前期从山东省金乡县连作大蒜根部分离的 70 株细菌为研究对象，以大蒜根腐病病原真菌拟枝孢镰刀菌 (Fusarium sporotrichioides) ACCC37402和大蒜叶枯病病原真菌链格孢属菌株 (Alternaria sp.) D14011-1 为对峙菌株，经两点对峙实验筛选获得一株细菌 DD3 对大蒜根腐病 ACCC37402 和叶枯病 D14011-1均具有明显的拮抗效果 (图 1)，抑菌率均为 45%。

2.2 菌株 DD3 的 16S rDNA 系统发育分析

以筛选获得的高效拮抗菌 DD3 的总 DNA 为模板，采用 16S rDNA 通用引物 27F 和 1492R，PCR 扩增到 16S rDNA 基因大小约 1.5 kb。测序结果经http://ezbiocloud.net/ 数据库在线比对，结果显示菌株DD3 的 16S rDNA 基因序列最高相似性菌株为沙漠枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T(AMXN01000021)，最高相似度为99.36%。采用邻近法，构建菌株 DD3、5 株与其高相似性芽胞杆菌属 (Bacillus) 菌株以及两个类芽胞杆菌属菌株的 16S rDNA 基因序列系统进化发育树 (图 2)，结果显示高效拮抗菌 DD3 与其 16S rDNA 基因序列最高相似性菌株 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T位于同一分支，说明它们具有高度同源性。经 16S rDNA 序列分析，将菌株 DD3 初步鉴定为芽胞杆菌属菌株 Bacillus sp。

2.3 菌株 DD3 的拮抗特性研究

表1 结果显示，菌株 DD 对氨苄青霉素钠、硫酸卡那霉素、青霉素钠、噻孢霉素等 11 种抗生素均无耐受性。

菌株 DD3 能在蛋白酶检测平板上出现明显透明水解圈 (图 3)，表明其具有蛋白水解能力；在 King’s B 培养基上，含菌株 DD3 的滤纸出现深黄色变化(图 3)，说明其具有产 HCN 能力；菌株 DD3 可以使CAS 蓝色检测液产生橘黄色透明圈 (图 3)，说明其具有产铁载体能力。

2.4 菌株 DD3 的促生特性研究

菌株 DD3 经过两次检测，都能在无氮平板上生长，初步判定其都具有固氮能力，经乙炔还原法测定，菌株 DD3 的固氮酶活性为 0.41 ± 0.09 nmol/(mg·h)；菌株 DD3 能在有机磷培养基上和无机磷培养基上形成透明圈 (图 4)，说明其同时具有溶解有机磷和无机磷的能力；在含 0.1% L-色氨酸的 DF 培养基中培养，与 Fe-H2SO4溶液不能发生颜色反应，说明其不具有产 IAA 能力；在 ADF 培养基中不能生长，说明该菌不具有产 ACC 脱氨酶能力。综上，菌株 Bacillus sp. DD3 具有多种抗病和促生特性。

2.5 温室条件下菌株 DD3 对大蒜根腐病 ACCC37402的抗病能力研究

图1 菌株 Bacillus sp. DD3 对大蒜根腐病和叶枯病病原真菌的拮抗能力Fig. 1 Antagonistic ability of Bacillus sp. DD3 against pathogenic fungi of garlic root rot and garlic leaf blight[注（Note）：37402—大蒜根腐病病原真菌拟枝孢镰刀菌 Pathogenic fungi of garlic root rot (Fusarium sporotrichioides); D14011-1—大蒜叶枯病病原真菌链格孢菌 Pathogenic fungi of garlic leaf blight (Alternaria sp.).]

图2 菌株 Bacillus sp. DD3 系统进化发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of Bacillus sp. DD3

表1 菌株 Bacillus sp. DD3 的功能特性Table1 The functional characterizations of Bacillus sp. DD3

图3 菌株 Bacillus sp. DD3 水解蛋白、产 HCN、产铁载体能力Fig. 3 Capacity of producing hydrolysis protein, HCN and siderophore of Bacillus sp. DD3

图4 菌株 Bacillus sp. DD3 溶磷能力Fig. 4 Phosphate solubilizing ability of Bacillus sp. DD3

接入大蒜根腐病病原真菌 ACCC37402 孢子液的大蒜根腐病发病率为 100%，对发病植株病健交界处进行再分离，经鉴定，再分离菌株与接种菌株完全相同，确认 ACCC37402 对大蒜具有致病力。经有效活菌计数，吸光值 OD600= 1 的 DD3 菌悬液活菌浓度为 1.8 × 106cfu/mL。接入菌悬液后可达到良好的抗病效果，抗病率达 80%，接入无菌发酵液后，抗病率为 30%。感染根腐病后的大蒜幼苗，在接种 DD3菌悬液和其无菌发酵液后，在株高、茎粗、株鲜重、株干重与感染根腐病的大蒜相比都有增加；SPSS 分析显示，与感病大蒜幼苗相比，接菌悬液和无菌发酵液后大蒜株高、株鲜重和株干重达到显著性差异，茎粗差异不显著。与不接菌对照相比，接菌悬液和无菌发酵液后大蒜各指标差异均不显著 (表 2)。可见，多功能菌 Bacillus sp. DD3 菌悬液可以达到较好的拮抗病原微生物的作用 (图 5)。

2.6 温室条件下菌株 DD3 对大蒜幼苗的促生能力研究

接菌后第 40 天收获蒜，分别测定大蒜株高、茎粗、株鲜重、株干重，结果显示，接种 DD3 菌悬液(DD3MB) 后大蒜茎粗、株高、株鲜重、株干重等与未接菌对照相比都有增加；接种无菌发酵液 (DD3AFL)后大蒜茎粗、株高、株鲜重、株干重等与未接菌对照相比也有增加，但增加效果不如菌悬液效果明显(图 6 )。SPSS 分析显示，与不接菌对照相比，接菌悬液后大蒜株高和茎粗达到显著性差异，株鲜重和株干重达到极显著差异。与不接菌对照相比，接无菌发酵液后大蒜株鲜重和株干重达到显著性差异 (表 3)，可见，DD3 菌悬液及其无菌发酵液对大蒜幼苗均具有一定的促生作用，DD3 菌悬液的促生效果更佳。

3 讨论

植物根际促生菌 (PGPR) 对土壤中非寄生性根际有害微生物与有害病原微生物起到生防作用，促进植物矿质元素的吸收和利用，可产生利于植物生长的代谢产物，从而促进植物生长发育[24]。芽胞杆菌(Bacillus) 作为一类重要的能拮抗病原真菌的 PGPR，部分菌株已经在农业生产中应用[25]。崔北米等[26]从大蒜鳞茎中分离内生细菌 19 株，其中菌株 Bacillus axarquiensis DSP6 对 9 种病原真菌具有较强的抑菌作用。Solanki 等[27]分离到使立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani) 病害分别减少 69.8% 和 61.5% 的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) MB101 和枯草芽胞杆菌 (Bacillus subtilis) MB14。枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 是一类好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，具有丰富多样的生理特征，在自然界中大量存在，并能产生抗逆性休眠体—芽孢，进而适应恶劣的环境，存活期较长[28]。枯草芽孢杆菌能产生多种抑制植物病原真菌的抗菌物质，且对人畜无害，不污染环境，因而在生物防治植物病害中起着重要的作用[29]。本研究从大蒜根际分离筛选获得的细菌 Bacillus sp. DD3，16S rDNA 序列最高相似性菌株为沙漠枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum (99.4%)，对大蒜根腐病病原真菌 ACCC37402 和大蒜叶枯病病原真菌 D14011-1 均具有明显的拮抗效果。

表2 接种多功能菌 Bacillus sp. DD3 及其无菌发酵液 (AFL) 感病大蒜幼苗的生长Table2 Growth of susceptible garlic seedlings inoculated with multifunctional Bacillus sp. DD3 and its axenic fermentation liquid (AFL)

图5 菌株 Bacillus sp. DD3 及其无菌发酵液对大蒜幼苗的抗病效果Fig. 5 Disease-resistance of garlic seedlings of Bacillus sp. DD3 suspension and its axenic fermentation liquid

图6 菌株 Bacillus sp. DD3 及其无菌发酵液对大蒜幼苗促生效果Fig. 6 Promoting effect on garlic seedlings of Bacillus sp. DD3 and its axenic fermentation liquid

表3 接种 Bacillus sp. DD3 菌悬液 (MB) 和无菌发酵液 (AFL) 大蒜幼苗的生长Table3 Growth of garlic seedlings inoculated with Bacillus sp. DD3 suspension and its axenic fermentation liquid

研究发现，具有较好应用前景或者已经在农业中广泛应用的抗病植物根际促生菌 (PGPR) 一般都兼具多种抗病促生机制，产生抗生素、蛋白酶、HCN等与拮抗相关的次级代谢产物的 PGPR，可以有效地抑制土传病害[8–9]；产铁载体 PGPR，可以融合土壤中的铁元素供植物利用，还可以与病原菌争夺铁元素，抑制病原菌繁殖[30]；具有固氮、解磷能力的PGPR，在一定程度上可以为自身和植物提供可利用氮和磷，促进植物生长[20, 24]。Burkholderia sp. 7016 能促进番茄生长，具有固氮、溶磷、产 ACC 脱氨酶活性和拮抗土传病害等功能特性[20]。Pseudomonas aeruginosa PM389 能促进狗尾草藜生长，具有拮抗土传病害、产铁载体、固氮、溶磷等功能特性[30]。Lin 等[11]筛选到能拮抗真菌病害的芽胞杆菌 21 株，同时具有固氮能力和产 IAA 能力，对黄瓜根腐病具

有明显抑制作用，并能促进黄瓜生长。本文筛选获得拮抗多种病原真菌的菌株 Bacillus sp. DD3 具有解蛋白能力、产 HCN 能力、产铁载体能力、对大观霉素具有耐受性、固氮能力、溶解有机磷和无机磷的能力。盆栽试验显示，接种 Bacillus sp. DD3 菌悬液可以使大蒜根腐病的防控效果达到 80%，接种Bacillus sp. DD3 菌悬液及其无菌发酵液后对大蒜幼苗具有一定的促生作用，其中菌悬液要比其无菌发酵液抗病促生效果更强。可见，多功能菌 Bacillus sp. DD3 兼具多种功能特性且对大蒜幼苗具有较好的促生效果，为防治大蒜土传病害、促进大蒜生长提供优良菌种资源。但是，本研究筛选的 Bacillus sp. DD3 功能特性是在室内纯培养的条件下进行，促生试验是在温室可控条件下开展的，在自然条件下菌株的拮抗促生效果一定会受土壤、植物、气候、土著微生物等诸多因素的影响。因此，该菌株是否能作为农业微生物菌剂应用，还需要大量的试验来探讨。

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Characterizations of rhizobacteria DD3 and their growth promoting effect on garlic seedlings

ZHANG Meng-qi1, CHEN Yun-yun2, ZHANG Xi2, DENG Hui2, SUN Jian-guang2, GAO Miao2*, BU Ning1*
( 1 College of Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang, Liaoning 110034, China; 2 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China )

【Objectives】Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) can promote plant growth, control disease and improve the crop yield, and have some advantages with environmental compatibility, no-resistance, lasting stability, and so on. Screening efficient multi-functional bacteria, researching on the mechanism of disease control and promoting growth have very important theoretical and realistic significance for development prevention and control microbial technology for garlic soil borne disease and the garlic industry of“high-yield, high-quality, high efficiency, ecology, safe”. 【Methods】 In this study, seventy bacteria ofprophase isolated from the rhizosphere of garlic in Jinxiang county of Shandong province were tested to screen bacteria with the ability of inhibiting the pathogenic fungi (Fusarium sporotrichioides) ACCC37402 and (Alternaria sp.) D14011-1. Bacteria were identified by 16S rDNA sequence analysis. The antagonistic characterizations were studied by measuring the sensitivity to antibiotic, the capability to hydrolyze proteins, the production of siderophore and hydrogen cyanide (HCN). The promoting characterizations was studied by measuring the ability to fix nitrogen and solubilize phosphate, and the production of indole-3-acetic acid (IAA) and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase. The greenhouse pot experiments were set up to study how the multi-functional bacteria and axenic fermentation extracts effect on the garlic seedling growth and disease resistance. 【Results】The bacterium DD3 was screened for antagonistic activity against the pathogenic fungi ACCC37402 (Fusarium sporotrichioides) and (Alternaria sp.) D14011-1, it showed antifungal index value of 45% inhibition to both pathogenic fungi. This strain was identified as Bacillus sp. based on 16S rDNA sequence analysis. Other functional characterizations’ results showed that the strain Bacillus sp. DD3 had the ability to proteolysis, the production of hydrogen cyanide (HCN) and siderophore, nitrogenase activity, and phosphate solubilizing ability. But, the strain DD3 did not present the sensitivity to ampicillin sodium, kanamycin sulfate and other eleven kinds of antibiotics. It produced the indole-3-acetic acid (IAA) and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase. In greenhouse experiments, 80% garlic plants inoculated with strain Bacillus sp. DD3 showed positive effect of prevention and control of root rot. Inoculation with both bacterial suspension and axenic fermentation of strain Bacillus sp. DD3 liquid promoted the growth of garlic seedlings，and the inoculation of strain Bacillus sp. DD3 suspension provided the optimum result. 【Conclusions】 Bacillus sp. DD3 with multifunctional characterizations showed antagonistic effects to garlic root rot and growth promoting of garlic seedlings. Therefore, Bacillus sp. DD3 has the potential to be developed as microbial fertilizer.

garlic; plant growth promoting rhizobacteria (PGPR); multifunctional bacterium; disease-resistant; promotion

2016–04–13 接受日期：2017–03–10

中央级公益性科研院所专项资金资助项目（IARRP-2015-17）资助。

张梦琦（1991—），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事微生物资源与应用研究。E-mail：423711258@qq.com * 通信作者 E-mail：gaomiao@caas.cn；309226126@qq.com