北川白山羊FABP3基因cDNA的克隆及表达研究

姚 毅，马红艳，吕学斌，杨跃奎*

（1. 运城农业职业技术学院，山西运城 044000；2. 四川省畜牧科学研究院，四川成都 610000）

北川白山羊FABP3基因cDNA的克隆及表达研究

姚 毅1，马红艳1，吕学斌2，杨跃奎2*

（1. 运城农业职业技术学院，山西运城 044000；2. 四川省畜牧科学研究院，四川成都 610000）

脂肪酸结合蛋白（Fatty aicd Binding Protein 3, FABP3）是细胞内脂类伴侣。本研究采用RT-PCR和RACE技术，分离并克隆山羊FABP3基因的cDNA序列，结合实时定量分析山羊FABP3在10个不同组织和5个不同泌乳时期的相对表达。结果表明：FABP3基因的mRNA序列全长为714 bp，包括5'非翻译区 64 bp，CDS区 402 bp和3'非翻译区 248 bp，共计翻译为133个氨基酸，山羊FABP3与GenBank中牛（Bos taurus）、小鼠（Mus musculus）和人（Homo sapiens）的核苷酸同源性较高，分别为96%、89% 、87%；蛋白质结构分析显示，FABP3蛋白分子量为 14.76 ku，等电点为6.11，不具有信号肽序列，没有跨膜结构；组织表达分析表明，FABP3基因在山羊的心脏组织中表达量最高，小肠次之，表达量最少的为肌肉组织；山羊5个不同泌乳时期乳腺组织FABP3的表达量分析表明，泌乳盛期的表达量最高，约为干奶期的130倍。

山羊；FABP3；克隆；组织表达

脂肪酸结合蛋白是一种低分子量的蛋白，有明显的组织特异性分布。在脂肪酸的转运、细胞生长、细胞信号和基因转录等方面发挥重要的作用[1]。脂肪酸结合蛋白在心肌细胞中能够协助脂肪酸的移动。有研究表明，在心室隔膜有缺陷的病人的心肌上，脂肪酸结合蛋白的表达显著上调[2]。在胚胎上皮癌细胞中，超表达脂肪酸结合蛋白可以抑制增殖和促进细胞凋亡[3]。在基因敲除鼠模型中，已经探索了脂肪酸结合蛋白的生理学作用。脂肪酸结合蛋白的敲除鼠主要集中在心脏和骨骼肌中脂肪酸代谢的效应方面，在这2种组织中，脂肪酸结合蛋白大量表达[4]。体内的标记研究显示[5]，脂肪酸结合蛋白敲除鼠的心脏组织中，棕榈酸和花生四稀酸的吸收减少了，在分离的心肌细胞中棕榈酸和花生四稀酸的吸收也少了。FABP3基因在牛泌乳的乳腺组织中表达量很高，特别是从非泌乳期到泌乳期，FABP3的mRNA表达量极大地上调了大约40倍以上[6]。除了运输脂肪酸的作用，脂肪酸结合蛋白也可以通过和激活的乙酰辅酶A结合进而保护细胞不受激活脂肪酸的负面效应。在鸡的研究中已经证明了脂肪酸结合蛋白和硬酯酰辅酶A脱氢酶有互相调控的关系，暗示了这两种蛋白可能在乳腺组织中协同发挥作用[7]。在牛的乳腺组织中，脂肪酸结合蛋白能够为硬酯酰辅酶A脱氢酶提供脂肪酸[8]。在牛的乳腺上皮细胞中的研究发现，脂肪酸结合蛋白的表达和活性在棕榈酸和硬脂酸的脱氢过程中发挥优先提供通道的作用，脂肪酸结合蛋白和棕榈酸以及硬脂酸有比较高的亲和力[9]。本研究旨在分析FABP3基因在不同组织和泌乳期的mRNA表达，探讨其在脂肪酸的转运和代谢中的功能和作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品 泌乳北川白山羊的乳腺组织样品利用外科手术法采集。选择乳腺组织左边或者右边四分之一位置靠中间补位进行采样（大约10 cm2），保证采样区域不重合。小心剃毛和清洗乳腺组织采样部位，注射通用麻醉剂，用手术刀切开3～4 cm的切口，避免割开任何大的皮下血管。采集2～3 g的乳腺组织，尽快放到液氮中，储存在-80℃备用。

1.1.2 主要试剂 提取RNA用的QIAzol购自德国QIAGEN公司，实验中用到的内切酶购自美国NEB公司、HieffTMqPCR SYBR®Green Master Mix购自上海翊圣生物科技有限公司，细胞中的RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒，DNA胶回收试剂盒和大肠杆菌菌株TOP 10购自北京天根生化科技有限公司，T4连接酶购自Promega公司，DEPC水、IPTG和氨苄青霉素购自四川利他利安科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据已知的奶牛和绵羊的FABP3基因序列，利用Primer 5软件设计北川白山羊FABP3基因CDS区上、下游引物，见表1。根据经测序检测正确的白山羊FABP3基因CDS区序列以及TaKaRa 3' RACE试剂盒设计3' RACE引物，参考FABP3基因CDS区序列以及Invitrogen公司的 5' RACE试剂盒说明，利用Primer 5软件设计5' RACE引物，见表1。

1.2.2 RNA 提取、cDNA 合成以及实时定量分析各组织中的总RNA提取利用TRIzol法进行，细胞内的总RNA提取参考天根总RNA提取试剂盒方法进行， RNA 经DNAase处理除去污染后进行反转录，反转录的方法参考TaKaRa的cDNA第1链合成试剂盒说明书操作。设计参照基因核糖体蛋白S9基因（RPS9）实时定量引物，通过RT-qPCR检测FABP3基因在5个不同泌乳时期和10个不同组织中的mRNA相对表达水平。本实验荧光定量反应体系为10 μL：SYBR Premix Taq 2×mix 5 μL，上、下游混合引物各0.4 μL，cDNA 0.4 μL，ROX Reference Dye（50×） 0.2 μL，ddH2O 4.0 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃ 31 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s绘制熔解曲线。以RPS9为内参基因，用2-ΔΔCt进行相对定量法分析。

1.2.3 山羊FABP3基因的克隆 利用PCR方法扩增FABP3基因CDS区，并按照Takara的3'-Full RACE Core Set的说明书操作来获取3 '侧翼端的序列，同时按照5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 的说明书操作来获取5'侧翼端的序列，以得到FABP3基因的cDNA全长序列。

1.2.4 生物信息学分析 将山羊FABP3基因的核苷酸序列放入NCBI网站中blastn（http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）中与其他物种的核苷酸序列进行比对，同时应用blastp对其氨基酸序列进行比对，并对其同源性进行分析。另外应用ExPASy网站中的ProtScale （http://web.expasy.org/protscale/）分析 FABP3基因氨基酸序列的疏水性，通过CBS Prediction Servers （http://www.cbs.dtu.dk/ services/）的TMHMM 和SignalP分别对FABP3基因的跨膜结构和信号肽区域进行预测。

1.2.5 统计分析 每个实验重复3次。利用SPSS22.0进行数据处理并用ANOVA检测显著性，结果表示为平均值±标准差，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

表1 山羊FABP3基因cDNA克隆引物序列信息

表2 用于实时定量的基因及其引物和引物扩增大小

2 结 果

2.1 山羊FABP3基因cDNA的克隆和序列分析通过RT-PCR和RACE技术，以山羊泌乳盛期乳腺的总RNA为模板，克隆获得山羊FABP3基因的cDNA全长序列，为714 bp （GenBank收录号为FJ844408）。通过对序列进行分析表明，该基因的开放阅读框（ORF）为 402 bp，编码133个氨基酸，ATG为其起始密码子，TGA为其终止密码子；5'UTR为64 bp，3'UTR b包含加尾信号AATAA和完整的poly （A）尾巴，长为248 bp。FABP3蛋白质的分子量为14 761 u，等电点（pI）为6.11。

2.2 山羊FABP3的同源性分析 通过以上序列比对发现，山羊FABP3基因的ORF与GenBank中已发表的牛（BC102153.1）、人（BC007021.1）和小鼠（NM_010174.1）FABP3基因相比较，具有较高的核苷酸相似性，分别为97%、 88%和83%，氨基酸序列同源性分别为 96%、89% 、 87%。其非翻译区核苷酸序列与牛、人和小鼠的相应序列相比较，5'UTR相似性为95%、97%和 31%，3'UTR相似性分别为94%、72%、77%。

图1 山羊FABP3跨膜结构预测

2.3 山羊FABP3的结构分析 SignalP预测分析表明，山羊FABP3无信号肽序列（图略）；而通过TMHMM跨膜结构预测则发现，此序列并无跨膜结构，如图1，表明山羊FABP3蛋白不是膜蛋白，符合相关报道的结果；蛋白质疏水性预测分析结果表明，FABP3具有较强的疏水结构，其亲水结构（score＜-2.0）和疏水区域（score＞1.0）同时存在于N端，且分布总体比较均匀，如图2，按分值大小划分，其疏水最大值为1.367，最小值为-2.444，分别位于第113和第76 AA处。

2.4 组织表达和泌乳不同时期表达分析 以RPS9基因为内参基因，通过RT-qPCR检测发现山羊FABP3基因在10个不同组织间均有表达，但差异较大。该基因在心脏组织和小肠中均具有较高的表达量，其次为在肾脏、脾脏、肝脏和脂肪组织中的表达量，瘤胃、肺和肌肉组织中的表达量较低。在干奶期的乳腺组织中表达量较低，约为肝脏组织的二十八分之一（图3）。通过荧光定量PCR检测发现，干奶期FABP3基因的表达量最低，伴随着泌乳的进行，FABP3基因的表达量逐渐升高，直到泌乳盛期、泌乳中期和泌乳末期FABP3基因的表达量又逐渐降低。泌乳盛期FABP3基因的表达量约为干奶期的130倍（P＜0.05），见图4。

图2 山羊FABP3的疏水结构预测

图3FABP3基因在山羊10个不同组织的相对表达分析

图4FABP3基因在山羊乳腺5个不同泌乳阶段的相对表达分析

3 讨 论

3.1 FABP3基因cDNA的克隆及序列和结构分析本研究克隆了北川白山羊FABP3基因的全长，通过同源性分析发现山羊FABP3基因CDS区核苷酸和氨基酸序列与牛、人和小鼠的同源性较高，均达到80%以上，说明FABP3基因在不同物种间功能区域较为保守。其非翻译区与其他物种序列相比差异性较大，说明山羊FABP3基因的调控机制可能不同于牛、人及小鼠该基因的调控机制。FABP3蛋白的跨膜结构域由疏水氨基酸残基（20个左右）构成，是与质膜蛋白结合的主要部位。ProtScale的预测结果显示，FABP3蛋白在113左右的肽段具有较强的疏水性，而在76、100左右的肽段亲水性较强， FABP3缺乏20个以上连续疏水的氨基酸结构，因此推测其可能不具备跨膜结构。SignalP的跨膜结构预测结果证实FABP3不具有跨膜结构，这与前面ProtScale预测结果一致，也与FABP3属于一种胞内蛋白的相关报道一致。FABP3的这些结构可能与其结合、运载脂肪酸等配体的功能有密切关系。

3.2 FABP3在不同泌乳时期和不同组织中的表达谱分析 FABP3在妊娠期就开始表达，泌乳初期的相对表达量为1，泌乳盛期的相对表达量为11.7，随泌乳停止而表达量急剧下降。乳腺中存在3种脂肪酸结合蛋白，FABP3是其中之一，主要与脂肪酸的摄取和定向转运、脂肪酸浓度调节和刺激乳中的酪蛋白合成相关[11]。泌乳盛期乳脂和乳蛋白的合成和需求增加，在盛期FABP3的表达大量上升是此时乳腺泌乳性能增大的需要。本研究进一步证明了FABP3在山羊泌乳期发挥重要作用，同时与乳腺脂质合成密切相关，在细胞内脂肪转运中有重要功能，与在奶牛和小鼠中的研究结果一致[12]。

FABP3在多种组织中普遍存在，特别是对脂肪酸有高度需求的组织[13]，如泌乳的乳腺、骨骼肌和心肌等组织。在动物未成熟的肌肉组织中，FABP3的表达量极微，而当细胞开始吸收脂肪酸补给能源时，FABP3的表达量才迅速提高。研究发现，FABP3基因在2月龄藏猪心脏组织和肌肉组织中的表达量最高，其次在肾脏组织中的表达量较高，在肝脏组织中的表达量最低[14]。在小鼠中发现，FABP3基因在心脏中高表达，在肾脏和肝脏中表达量较低。FABP3基因在不同的组织和泌乳期mRNA表达的差异暗示了其可能在脂肪酸的转运和代谢方面发挥不同特异性的功能和作用。

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S827.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-054

2017-03-16；

2017-04-18

国家科技支撑计划（2011BAD28B01）

姚毅（1979-），男，山西河津人，讲师，硕士，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：11748276@qq.com * 通讯作者：杨跃奎，E-mail: 1476079908@qq.com