引起天然茶枯膏酸败的微生物分离与鉴定

刘小玉，付登强，余凤玉，贾效成，陈良秋，赵志浩

（中国热带农业科学院椰子研究所油茶研究中心，海南文昌 571339）

引起天然茶枯膏酸败的微生物分离与鉴定

刘小玉，付登强，余凤玉，贾效成，陈良秋，赵志浩

（中国热带农业科学院椰子研究所油茶研究中心，海南文昌 571339）

近年来，我国油茶产业得到了快速的发展，种植面积逐年上升，茶枯是油茶籽经榨油后剩下的渣饼，产量大，营养丰富，生物活性作用多。但茶枯膏易酸败，影响其应用。本文采用传统的微生物分离培养法，对酸败天然茶枯膏中的微生物进行了分离、纯化，共获得5株细菌。然后进行菌落形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列和系统发育分析等研究，初步鉴定菌株ckg-l-01、ckg-l-02、ckgp-01、ckg-p-02均为枯草芽孢杆菌，ckg-l-03为解淀粉芽孢杆菌。该研究为抑制天然茶枯膏酸败、延长其保质期的技术研发奠定基础。关键词：天然茶枯膏；酸败；微生物；分离与鉴定

在国务院和各级地方政府的高度重视下，我国油茶产业得到了快速的发展。目前，全国油茶种植面积接近400万hm2，年产茶油量达51.8万t[1]。茶枯是油茶籽经榨油后剩下的渣饼，其产量是茶油的2～3倍，富含多种营养成分，如蛋白、脂肪、糖类等，还有抗营养因子成分，如茶皂素、生物碱、多酚类等[2，3]。茶皂素是一种天然非离子型表面活性剂，具有良好的乳化、分散、发泡、湿润等功能；水解茶籽蛋白能有效提高洗发水的保湿性能，使头发易于梳理并富有光泽，对头发具有一定的药理作用[4]。我国古代早有用茶枯洗头的传统，但因使用不方便，粘膜刺激性强等缺点，仅在少数油茶产区仍保留使用。茶枯高值化利用成了油茶产业发展的重要方向，利用茶枯研制洗发用品是茶枯高值化利用的主要方向之一。天然茶枯膏是经过双酶水解茶枯制备而成，能有效降低茶枯残油含量和粘膜刺激性，增强清洁力和使用方便性，产物富含茶枯水解蛋白、茶皂素等，长期使用有杀菌、止痒、控油、去屑、修复受损发质等功效，还有明显的乌发、防脱发等作用，是极佳的天然护发产品。但是天然茶枯膏保质期比较短，在室温下30d左右即开始酸败，因而制约了它的商品性开发。

酸败通常是由霉菌或细菌造成的，因为有些霉菌（如黑曲霉）和细菌（如醋酸杆菌）在生长发育过程中能产生柠檬酸和醋酸等代谢产物，致使产品酸败，pH降低[5]。本研究是采集酸败的天然茶枯膏，分离并筛选出其中的微生物，并通过菌落形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列和系统发育分析等研究对菌株进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 实验材料

茶枯，本研究室采用海南传统热榨法榨取茶油后剩余的枯饼。

酸败的天然茶枯膏，采用本研究室发明的双酶水解茶枯制备而成，专利申请号：201510939400.3，在室温条件下保存1个月以上。

1.2 天然茶枯膏酸败微生物的分离与鉴定

1.2.1 培养基

LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

1.2.2 酸败微生物的分离纯化

称取10g变质天然茶枯膏置于盛有90mL无菌水的三角瓶中，振荡30min（160r/min），制成悬浮液。取其上清液依次稀释成10-2、10-3、10-4g/mL，各吸取0.1mL分别涂布于LB培养基平板上，于28℃恒温培养箱中倒置培养。待菌落长出后，挑取单菌落划线纯化，并将纯化的菌株接种到斜面LB培养基上，置于4℃的冰箱中保存待用。

1.2.3 酸败微生物的鉴定

（1）菌株形态特征和主要生理生化特征

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[6]对菌株的形状、颜色、透明度、生长速度等菌落形态特征及吲哚试验、氧化酶、革兰氏染色、淀粉水解、V-P试验、明胶液化、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验等主要生理生化特征进行试验和观察记录。

（2）16SrDNA序列分析

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离纯化得到的细菌DNA。PCR扩增选用通用引物27F5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′。反应体系50μL（1μL模板、1μL 1492R、1μL 27F、25μL PCR mastermix、22μL ddH2O）。PCR扩增（94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行35个循环，72℃终延伸10min，4℃保存），取50μL PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，在紫外灯下观察、并拍照保存。将PCR产物送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。

（3）系统发育分析

将序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析，采用BioEdit、Mega5.0等软件对菌株进行系统发育分析，采用邻接法（Neighbour-joining，NJ法）构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 酸败微生物的分离纯化

从酸败的天然茶枯膏中共分离筛选得到5株细菌，即ckg-l-01、ckg-l-02、ckg-l-03、ckg-p-01、ckg-p-02，结果如表1（见下页）所示。

2.2 酸败微生物的鉴定

2.2.1 菌株的形态特征

表1显示的是5株细菌的形态特征。由表可知，菌株ckg-l-01在LB培养基上生长情况较好，培养48h后，菌落形状不规则，表面光滑，扁平，淡黄色，不透明，湿润，扁平，无色素产生，菌落中等大小；菌株ckg-l-02在LB培养基上生长较好，培养48h后，菌落不规则，表面淡黄色，背面淡红色，不透明，干燥，表面凸起，有色素产生，菌落中等大小，生长速度中等；菌株ckg-l-03在LB培养基上生长速度慢，培养48h后，菌落圆形，淡黄色，不透明，干燥，表面凸起，无色素产生，菌落小；菌株ckg-p-01在LB培养基上生长速度慢，培养48h后，菌落不规则，淡黄色，不透明，表面湿润，扁平、无色素产生，菌落小；菌株ckg-p-02在LB培养基上生长较好，生长速度快，培养48h后，菌落圆形，淡黄色，不透明，表面湿润光滑、扁平，无色素产生，菌落大。

2.2.2 菌株的生理生化特征

对5株细菌的生理生化特征鉴定有吲哚试验、氧化酶、革兰氏染色、淀粉水解、V-P试验、明胶液化、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验等，结果见表2。5株菌在吲哚试验、氧化酶试验中均表现为阴性，在革兰氏染色、淀粉水解试验、明胶液化试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验中均表现为阳性，且均能利用葡萄糖；而只有菌株ckg-l-02 V-P试验呈阴性，其余4株菌V-P试验均表现为阳性。对照参照《伯杰氏细菌鉴定手册》得知，菌株ckg-l-01、ckg-l-02、ckg-p-01、ckg-p-02与枯草芽孢杆菌生理生化特征相符，菌株ckg-l-03与解淀粉芽孢杆菌的生理生化特征相符。

2.2.3 16S rDNA序列测定及其系统发育分析

分别以5株细菌的DNA为模板，采用通用引物扩增出约为1500bp左右的片段，琼脂凝胶电泳检测后进行测序。将5株菌16SrDNA基因序列提交到GenBank数据库，其登录号分别为5239MJPD01R、523BUXYY01R、5232HDR2015、523DBE5V01R、523EYPEH01R，并运用BioEdit、Mega5.0软件构建系统发育树（图1）。由图1可知（见下页），5株菌均属于芽孢杆菌属（Bacillus），其中菌株ckg-l-01、ckg-l-02、ckg-p-01、ckg-p-02与GenBank中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）同源性最高，相似性大于99%，菌株ckg-l-03与GenBank中的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）同源性最高，相似性大于99%。再结合细菌的形态特征、生理生化测定结果和系统发育分析结果，初步确定ckg-l-01、ckg-l-02、ckg-p-01、ckg-p-02为枯草芽孢杆菌，菌株ckg-l-03为解淀粉芽孢杆菌。

表1 5株细菌的菌落特征

表2 5株细菌生理生化特性

图1 5株细菌的系统发育树

3 结论

本研究通过从酸败的天然茶枯膏中分离、纯化获得5株细菌，结合菌株菌落形态特征、生理生化试验、16S rDNA序列分析及系统发育分析等，初步鉴定菌株ckg-l-01、ckg-l-02、ckg-p-01、ckg-p-02均为枯草芽孢杆菌，ckg-l-03为解淀粉芽孢杆菌，因而得知引起天然茶枯膏酸败的微生物是枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。

茶枯中富含蛋白、脂肪、糖类、茶皂素、生物碱和多酚类等多种生物活性成分，但是目前茶枯尚未得到充分的开发利用，价值没有得到充分的发挥，茶枯高值化利用成

Isolation and Identification of Microorganism s from Rancidity Natural Sham poo of Oil Camellia Cake

LIU Xiao-yu,FU Deng-qiang,YU Feng-yu,JIA Xiao-cheng,CHEN Liang-qiu,ZHAO Zhi-hao
(Coconut Research Institute,CATAS,Wenchang 571339,China)

Camellia industry in our country has been developed rapidly,and the planting area has been increasing year by year.Oil camellia cake are the rest of the residue after camellia seed,and its production is large and nutrient rich,but natural shampoo of oil camellia cake is easy to rancidity,which limits its promotion and application.Using traditional method of isolation and culture of microorganisms,five strains were screened from natural shampoo of oil camellia cake rancidity.According to morphology of the colony,physiological and biochemical properties,16S rDNA and phylogenetic analysis,strain ckg-l-01,strain ckg-l-02,strain ckg-p-01 and strain ckg-p-02 were preliminarily identified as Bacillus subtilis,strain ckg-l-03 was preliminarily identified as Bacillus amyloliquefaciens.The study laid the foundation for the suppression of rancidity natural shampoo of oil camellia cake,and it extend the shelf-life of natural shampoo of oil camellia cake,in order to quicken the pace of high value utilization of oil camellia cake.

Natural shampoo of oil camellia cake;rancidity;microorganism;isolation and identification

S794.4

A

1008-1038(2017)05-0010-04

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.05.004

2017-01-12

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目（NO.1630152016008）；海南省产学研一体会专项项目（cxy20150020）

刘小玉（1986—），女，助理研究员，主要研究方向为油茶丰产栽培技术及副产物综合利用