克拉霉素联合布地奈德对COPD大鼠糖皮质激素抵抗的影响*

孙盼锋,张 辉,黄仕夫,黄凤祥,赵 娣,苗丽君

郑州大学第一附属医院呼吸内科 郑州 450052

克拉霉素联合布地奈德对COPD大鼠糖皮质激素抵抗的影响*

孙盼锋,张 辉,黄仕夫,黄凤祥,赵 娣,苗丽君#

郑州大学第一附属医院呼吸内科 郑州 450052

#通信作者，女，1970年5月生，博士，教授，主任医师，研究方向：呼吸系统疑难疾病的基础与临床、肺癌的发病机制与治疗，E-mail:miaolily@126.com

克拉霉素；布地奈德；慢性阻塞性肺疾病；糖皮质激素抵抗；糖皮质激素受体；大鼠

目的：探讨克拉霉素联合布地奈德对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠糖皮质激素抵抗的影响。方法：对大鼠进行COPD造模，然后分4组处理，COPD组、克拉霉素组、布地奈德组和联合干预组(克拉霉素+布地奈德组)，每组10只；以10只未处理未造模大鼠作空白对照(空白组)。留取各组大鼠肺组织和血清，HE染色，光镜下观察肺组织病理学改变，采用ELISA法测定血清中TNF-α水平，采用RT-PCR及Western blot检测肺组织糖皮质激素受体α(GRα)及GRβ的表达。结果：与空白组相比，COPD组大鼠气管及支气管黏膜上皮细胞脱落，炎性细胞浸润，支气管平滑肌增厚，肺泡壁变薄，甚至破裂融合成肺大泡，血清TNF-α水平升高，提示造模成功。对COPD组、克拉霉素组、布地奈德组和联合干预组的分析表明，克拉霉素和布地奈德均可降低COPD大鼠血清TNF-α水平和肺组织GRβ mRNA和蛋白的表达水平，升高肺组织GRα mRNA和蛋白的表达水平，且二者联用有协同作用(P<0.05)。结论：克拉霉素、布地奈德均可在不同程度上调节GRα/GRβ失衡，从而改善COPD大鼠糖皮质激素抵抗，二者联用抗炎效果更佳。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系统一种严重危害人类健康的常见病、多发病，典型特征是持续性的气流受限，呈进行性发展[1]。COPD本质上是气道的慢性炎症性疾病，因此治疗的核心是抗炎。糖皮质激素具有强大的抗炎作用，是COPD治疗的主要药物，但部分COPD患者即使用大剂量糖皮质激素治疗，除了增加副作用外，效果却甚微，这表明COPD患者体内可能存在某种机制导致机体对糖皮质激素的敏感性降低，即糖皮质激素抵抗。目前研究[2-3]认为：糖皮质激素受体α亚型(glucocorticoid receptor α，GRα)是发挥糖皮质激素效应的主要受体，而β亚型(GRβ)则是效应的内源性拮抗剂，激素抵抗型的哮喘及血液病患者GRα表达下调、GRβ表达上调，因此推测GRα/GRβ失衡是糖皮质激素抵抗的重要原因。大环内酯类药物已经被广泛用于稳定期COPD的治疗。克拉霉素是大环内酯类药物中较新的一个，耐药率低[4]，其在COPD中的抗炎及抗氧化作用已获公认[5]，但是关于克拉霉素治疗COPD的机制是否与逆转糖皮质激素抵抗有关，国内外研究较少。该研究旨在讨论克拉霉素联合糖皮质激素布地奈德对COPD大鼠糖皮质激素抵抗的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠(合格证编号：41003100001116)，质量(180±20) g，9周龄，购自河南省实验动物中心。克拉霉素(四川蜀中药业有限公司)，布地奈德混悬液(瑞典AstraZenca公司)，ELISA检测试剂盒(科密欧公司)，兔抗大鼠GRα、GRβ多克隆抗体(美国BioVision公司)，RT试剂盒、PCR试剂盒(Fermentas MBI公司)，引物(北京博大泰克公司)，通用型SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 大鼠COPD模型的构建 大鼠适应性饲养1周后分为空白组(10只)、模型组(40只)。模型组于第1、31、61天，经气管分别灌注0.2 mL 1 g/L 脂多糖溶液，于第2～30、32～60、62～90天在自制的60 L玻璃熏烟箱中被动吸烟6 h。空白组给予0.2 mL生理盐水和新鲜空气处理。

1.3 实验分组及取材 将模型大鼠随机分为COPD组、克拉霉素组、布地奈德组、联合干预组，每组10只。COPD组：从第91天开始给予生理盐水灌胃，1次/d，2 mL/只,共30 d。克拉霉素组：从第91天开始给予克拉霉素灌胃，1次/d，50 mg/kg(现配现用)，共30 d。布地奈德组：从第91天开始在自制熏烟箱雾化吸入布地奈德，1次/d，1 mg/只，共30 d。联合干预组：克拉霉素灌胃，同时布地奈德雾化吸入，方法同上。30 d 后，解剖大鼠，采集大鼠腹主动脉血，离心后取血清；分离大鼠右肺前叶，留取肺组织。

1.4 ELISA测定血清中TNF-α水平 操作按ELISA试剂盒说明进行，以标准品的浓度为横坐标，450 nm波长的光密度值为纵坐标，绘制双对数曲线，根据样品光密度值和双对数曲线计算其对应值。

1.5 大鼠肺组织HE染色 取部分肺组织固定、包埋、切片，HE染色后在100倍光学显微镜下观察。

1.6 RT-PCR法测定肺组织GRα、GRβ mRNA的表达 取肺组织，研磨后提取RNA，反转录为cDNA。GRα上游引物：5’-TCCAAAGCCGTTTCACTG-3’，下游引物：5’-CAAGAGGTCAAAGGTGCT-3’，扩增片段为348 bp。GRβ上游引物：5’-TGGTTTCCTGT TCGCTCT-3’，下游引物：5’-TGGTTTCCTGTTCGCTCT-3’，扩增片段为266 bp。GAPDH上游引物:5’-GT TCAACGGCACAGTCAA-3’，下游引物:5’-CAGATC CACAACGGATACA-3’，扩增片段为571 bp。然后行PCR扩增：取反转录产物2 μL，上下游引物各1 μL，10×Easy Tag Buffer(含Mg2+)5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，Easy Tag DNA Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外线投射仪下观察电泳条带。GRα及GRβ mRNA的表达水平以目的条带和GAPDH灰度值的比值表示。

1.7 Western blot法测定肺组织GRα、GRβ蛋白的表达 以组织蛋白裂解液裂解肺组织后取上清，用Brad-ford法测定蛋白浓度。取一份蛋白样品，制胶、上样、电泳分离、脱水。分别加兔抗大鼠GRα、GRβ多克隆抗体(按1:1 000稀释)及二抗(按1:4 000稀释)孵育。ECL发光，凝胶成像仪成像，至胶片透明为止，将胶片扫描后用Bandscan 5.0软件进行灰度分析。

1.8 统计学处理 应用SPSS 19.0处理数据。采用两独立样本的t检验比较空白组和COPD组血清TNF-α水平的变化及肺组织GRα、GRβ蛋白及mRNA表达水平的差异，采用2×2析因设计的方差分析比较COPD组、克拉霉素组、布地奈德组及联合干预组以上指标的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 5组大鼠肺组织病理学表现 见图1。与空白组相比，COPD组大鼠气管及支气管黏膜上皮细胞脱落，炎性细胞浸润，支气管平滑肌增厚，胶原沉积，肺泡壁变薄，甚至破裂融合成肺大泡，与COPD患者的气管及肺组织病理学变化一致。克拉霉素组、布地奈德组和联合干预组肺组织病理学表现较COPD组减轻。

2.2 5组大鼠血清TNF-α水平，肺组织中GRα、GRβ表达的比较 结果见图2、3，表1、2。由表1可知，COPD组大鼠血清TNF-α水平、肺组织GRβ表达水平高于空白组，GRα表达水平低于空白组。由表2可知，克拉霉素和布地奈德均可降低COPD大鼠血清TNF-α水平和肺组织GRβ的表达水平，升高肺组织GRα的表达水平，且二者联用有协同作用(P<0.05)。

A、B、C、D、E：分别为空白组、COPD组、布地奈德组、克拉霉素组和联合干预组。图1 各组大鼠肺组织HE染色结果(×100)

1～5：分别为空白组、COPD组、克拉霉素组、布地奈德组和联合干预组。图2 各组大鼠GRα及GRβ mRNA的表达

1～5：分别为空白组、COPD组、克拉霉素组、布地奈德组和联合干预组。图3 各组大鼠肺组织GRα、GRβ蛋白的表达

表1 空白组与COPD组大鼠血清TNF-α及肺组织GRα、GRβ蛋白及mRNA表达水平比较

表2 4组大鼠血清TNF-α及肺组织GRα、GRβ蛋白及mRNA表达水平比较

3 讨论

COPD是以气流阻塞为主要症状的慢性气道炎症性疾病。被动吸烟是构建COPD的经典方法，被动吸烟30周以上即可成功构建COPD模型[6]，但为了缩短实验时间，节省实验经费，目前多采用联合方法构建COPD模型。该实验采用连续被动吸烟12周联合气道内3次滴入脂多糖构建COPD大鼠模型[7]，结果显示，光学显微镜下，COPD大鼠肺组织病理改变与人类COPD的慢性支气管炎及肺气肿的病理改变相一致，说明模型构建成功。COPD大鼠血清TNF-α水平、肺组织GRβ表达升高，GRα表达降低，证实炎症和GRα/β失衡参与了COPD的发生。

糖皮质激素具有强大的抗炎作用，广泛用于治疗一系列的炎症和免疫疾病[8]。该研究结果表明，布地奈德可降低COPD大鼠血清炎症因子TNF-α水平，升高肺组织GRα mRNA和蛋白的表达水平，降低GRβ mRNA和蛋白的表达水平，提示布地奈德可通过改善COPD大鼠的糖皮质激素抵抗状态抑制炎症。

大环内酯类药物除了抗感染作用之外,还有显著的抗炎作用，因此大环内酯类药物已经被广泛用于稳定期COPD的治疗。研究[8]发现克拉霉素用于治疗急性加重期COPD患者,可显著降低患者血清中IL-1β和TNF-α等炎症因子的表达水平。随着罗红霉素的耐药，克拉霉素作为一种新药广泛应用于临床[9]。该研究表明：克拉霉素可以降低COPD大鼠血清TNF-α水平，改善糖皮质激素抵抗状态。

最后，该研究结果还显示，克拉霉素和布地奈德联用在调节GRα/GRβ失衡和抗炎方面具有协同效应。

综上所述，克拉霉素、布地奈德均可在不同程度上调节GRα/GRβ失衡，改善COPD大鼠糖皮质激素抵抗；二者联用抗炎效果更佳。

[1]佚名.2016GOLD：COPD 诊断、治疗与预防全球策略(更新版)[J].中国全科医学,2016，19(5):524

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[3]GEER EB,ISLAM J,BUETTNER C.Mechanisms of glucocorticoid-induced insulin resistance: focus on adipose tissue function and lipid metabolism[J].Endocrinol Metab Clin North Am,2014,43(1):75

[4]HERATH SC,POOLE P.Prophylactic antibiotic therapy in chronic obstructive pulmonary disease[J].JAMA,2014,311(21):2225

[5]AMMIT AJ.Glucocorticoid insensitivity as a source of drug targets for respiratory disease[J].Curr Opin Pharmacol,2013,13(3):370

[6]ZHENG H,LIU Y,HUANG T,et al.Development and characterization of a rat model of chronic obstructive pulmonary disease(COPD) induced by sidestream cigarette smoke[J].Toxicol Lett,2009,189(3):225

[7]高增艳.红霉素对COPD大鼠组蛋白云乙酰化酶2活性与糖皮质激素抵抗的影响及机制[D].郑州:郑州大学,2013.

[8]KEENAN CR,LEW MJ,STEWART AG.Biased signalling from the glucocorticoid receptor:Renewed opportunity for tailoring glucocorticoid activity[J].Biochem Pharmacol,2016,112:6

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(2016-06-28收稿 责任编辑徐春燕)

Effect of clarithromycin and budesonide on glucocorticoid resistance in COPD rats

SUNPanfeng,ZHANGHui,HUANGShifu,HUANGFengxiang,ZHAODi,MIAOLijun

DepartmentofRespiratoryDisease,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

clarithromycin;budesonide;chronic obstructive pulmonary disease;glucocorticoid resistance;glucocorticoid receptor;rat

Aim: To explore the effect of clarithromycin and budesonide on chronic obstructive pulmonary disease(COPD) rat glucocorticoid resistance and its mechanism.Methods: Rats were randomly allocated into 5 groups, blank group,COPD group,clarithromycin group,budesonide group, and combined intervention group；10 rats in each group.The rats in the latter 4 groups were made COPD model. The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining. Level of TNF-α in serum was determined by ELISA. The expressions of glucocorticoid receptor α(GRα) and GRβ mRNA and protein in lung tissue were detected by RT-PCR and Western blot.Results: Compared with blank group, there were tracheal and bronchial epithelial cells shedding, inflammatory cell infiltration, thickening of bronchial smooth muscle, alveolar wall thinning or even ruptured and fused into bullae of lung,and the level of serum TNF-α increased in COPD group(P<0.05). Compared with COPD group,the level of serum TNF-α and the expressions of GRβ mRNA and protein decreased in clarithromycin group and budesonide group, while those of GRα mRNA and protein increased(P<0.05),and the 2 drugs had synergistic effects(P<0.05).Conclusion: Clarithromycin or budesonide could adjust GRα/GRβ imbalance,reverse glucocorticoid resistance in COPD rats,and the antiinflammatory effect is synergistic when they are combined.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.020

*河南省科技厅攻关项目 162102310196

R563.9