上调FOXC1的表达对SKOV3细胞增殖及侵袭的影响*

任琛琛，刘泇希，杨 立，薛景戈，李飞燕，刘 灵，李 静，白 杨

郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052

上调FOXC1的表达对SKOV3细胞增殖及侵袭的影响*

任琛琛△，刘泇希，杨 立，薛景戈，李飞燕，刘 灵，李 静，白 杨

郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052

△女，1968年11月生，博士，教授，研究方向：妇科肿瘤，E-mail：renchenchen1106@126.com

SKOV3细胞；FOXC1；增殖；侵袭

目的：探讨上调FOXC1的表达对卵巢浆液性腺癌SKOV3细胞增殖及侵袭的影响。方法：分别以重组FOXC1慢病毒、慢病毒空载体稳定感染SKOV3细胞(实验组和载体对照组)，并以未感染慢病毒的SKOV3细胞为空白对照组，分别应用qRT-PCR和Western blot法检测3组细胞中FOXC1 mRNA和蛋白的表达情况，应用CCK-8法检测3组细胞接种24、48、72 h后的增殖能力，用Transwell小室检测接种24 h细胞的体外侵袭能力。结果：实验组SKOV3细胞FOXC1 mRNA及蛋白的表达均较载体对照组及空白对照组升高(P<0.05)。与空白对照组及载体对照组相比，实验组SKOV3细胞感染不同时间的增殖活性均降低，侵袭能力亦降低(P<0.05)。结论：上调FOXC1的表达能够抑制SKOV3细胞的增殖及侵袭能力。

卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是女性生殖系统的恶性肿瘤之一，其中卵巢浆液性腺癌是EOC中最常见的病理类型[1]。由于发病隐匿，多数EOC患者就诊时已是晚期，目前在发达国家EOC的病死率居妇科肿瘤之首[2]。因此，了解EOC的发病机制对早期诊断及有效治疗至关重要。FOXC1是叉头框(forkhead box,FOX)家族的一员，通过自身的叉头区DNA结合域结合目的基因片段启动转录。目前已知FOXC1在胚胎发育和眼睛发育的调节中具有重要作用，其基因突变可导致人类Axenfeld-Rieger畸形等疾病[3]。近年来发现FOXC1除了参与细胞或器官分化及代谢等生物学过程外，还可能与多种肿瘤(乳腺癌、肝癌、胃癌等)的发生发展也密切相关[4-6]。研究[7-8]表明：FOXC1在不同病理分型的EOC组织中的阳性表达率存在差异，提示FOXC1可能参与了EOC的发生发展甚至转移过程，但具体的生物学功能尚不明确。为进一步了解FOXC1在EOC恶性生物学行为中的作用，该研究应用慢病毒感染卵巢浆液性囊腺癌细胞SKOV3，外源性上调FOXC1后，观察SKOV3细胞增殖及侵袭力的变化，为进一步探讨FOXC1在EOC发生发展中的生物学功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 SKOV3细胞株由第四军医大学病原生物学教研室赵亚教授惠赠。FOXC1多克隆抗体(ab5079)购自英国Abcam公司，RPMI 1640培养基及胰蛋白酶购自美国Hyclone公司。FOXC1慢病毒过表达质粒(p-EGFP-慢病毒过表达质粒)、qPCR引物及All-in-OneTMqPCR Mix检测试剂盒均购自美国GeneCopoeiaTM公司。Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质凝胶购自Sigma公司。CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司。

1.2 慢病毒感染及稳定株的筛选 以7×104个/孔的密度将SKOV3细胞接种于24孔板。每孔分别加入滴度为5×108Tu/mL FOXC1慢病毒过表达质粒的慢病毒颗粒(实验组)10 μL后再加入聚凝胺，至终浓度为5 mg/L，摇动混匀后放入37 ℃培养箱继续培养24 h。同样设置载体对照组(感染慢病毒空载体)、空白对照组(未感染慢病毒的SKOV3细胞)。12 h后更换新鲜培养基。72 h后使用终质量浓度为2 mg/L嘌呤霉素筛选培养1周。在荧光显微镜下观察细胞荧光，直至抗药克隆出现，继续培养至克隆融合，随后用胰蛋白酶消化，传代至新的培养瓶进行培养及扩培，用于后续实验。

1.3 qRT-PCR检测3组细胞FOXC1 mRNA的表达水平 Trizol法提取3组细胞总RNA，反转录合成cDNA。按照All-in-OneTMqPCR Mix检测试剂盒说明书进行qRT-PCR检测。FOXC1引物序列：上游5’-CTTCTTCCTTGCCTCTCA-3’，下游5’-TCCACGA CATCCAACTAC-3’。 GAPDH引物序列:上游5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’,下游5’-GGTG GAATCATATTGGAACA-3’。反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,35个循环。每个样品设置3个复孔，检测结果取平均值后根据公式2-ΔΔCT计算FOXC1 mRNA的相对表达水平。实验重复3次。

1.4 Western blot法检测3组细胞FOXC1蛋白的表达水平 将3组细胞分别接种于10 cm细胞培养皿中，细胞密度达到90%后在冰上采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。以50 μg蛋白上样量进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完成后湿转法转移蛋白至PVDF膜。加入50 g/L脱脂奶粉TBST溶液室温封闭2 h,TBST洗涤3次。分别加一抗(FOXC1多克隆抗体按1:1 000稀释，β-actin单抗按1:5 000稀释)，4 ℃孵育过夜。次日应用TBST洗膜3次，加FITC标记的二抗(按1:2 000稀释)室温避光孵育2 h。TBST洗膜3次，应用CLX Odyssey扫描仪扫描PVDF膜，系统软件自动生成灰度值，以β-actin为内参，计算FOXC1蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

1.5 CCK-8法检测接种不同时间后3组细胞的增殖情况 取处于对数生长期的3组SKOV3细胞，以3×103个/孔接种于96孔板，每组均设置5个平行孔。在接种后的0、24、48、72 h，用CCK-8试剂盒检测细胞在450 nm处的吸光度值，表示细胞增殖活性。

1.6 体外侵袭实验检测接种24 h 3组细胞的侵袭能力 将50 μL Matrigel胶铺在Transwell小室的上室，37 ℃放置8 h。每组均在小室的上室中接种1×105个细胞，下室中加入600 μL完全培养基，置于培养箱培养24 h后用棉签擦净上室内细胞，PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛固定20 min后，吉姆萨染液染色5 min。PBS洗涤30 min，通风晾干后，选择5个视野计数染色细胞，即为穿膜细胞数，取平均值。实验重复3次。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0处理数据。采用单因素方差分析比较3组SKOV3细胞中 FOXC1 mRNA和蛋白的表达水平、细胞增殖活性及穿膜细胞数，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 FOXC1过表达的SKOV3细胞稳定株的筛选

慢病毒感染的SKOV3细胞中绿色荧光蛋白的表达情况见图1。3组细胞中FOXC1蛋白(图2)及mRNA的表达水平比较见表1。与载体对照组和空白对照组相比，实验组细胞中FOXC1在mRNA和蛋白水平均呈高表达。

A：实验组；B：载体对照组。图1 慢病毒感染后SKOV3细胞荧光显微镜下的观察结果(×40)

1：空白对照组；2：载体对照组；3：实验组。图2 3组SKOV3细胞FOXC1蛋白的表达情况

表1 3组SKOV3细胞中FOXC1 mRNA和蛋白表达水平的比较

*：与其余2组相比，P<0.05。

2.2 3组SKOV3细胞增殖活性的比较 3组SKOV3细胞接种24、48、72 h后增殖活性的比较见表2。由表2可见，接种24、48、72 h后实验组的增殖活性低于载体对照组及空白对照组。

表2 3组SKOV3细胞不同培养时间增殖活性的比较

*：与载体对照组和空白对照组相比，P<0.05。

2.3 3组SKOV3细胞体外侵袭能力的比较 接种24 h后，实验组、载体对照组、空白对照组的穿膜细胞数分别为(100.1±3.2)，(167.1±1.0)和(168.9±1.9)，3组间相比，差异有统计学意义(F=315.858，P<0.001)；与载体对照组及空白对照组相比，实验组穿膜细胞数明显减少(P<0.001)。

3 讨论

EOC是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其中卵巢浆液性腺癌占EOC的75%，因缺乏特异性早期诊断指标以及有效的个体化治疗，EOC患者的5 a生存率仅有30%左右[9]。

转录因子FOXC1位于人染色体6p25上，近年来认为FOXC1与肿瘤的生物学行为有关，该基因突变导致的FOXC1表达缺失或异常活化均能引发许多疾病。目前有研究[7]提示：卵巢浆液性囊腺癌SKOV3和HO-8910细胞系中FOXC1在mRNA及蛋白水平均有表达，但FOXC1在EOC的发生发展中究竟扮演了怎样的角色尚不明确。该研究选取SKOV3为实验对象，利用慢病毒作为转导载体感染SKOV3细胞，大大提高了转导效率，使其能够稳定表达外源基因。结果显示，实验组FOXC1的表达在mRNA水平和蛋白水平均较载体对照组及空白对照组升高，说明通过慢病毒感染SKOV3细胞能够有效上调FOXC1在该细胞中的表达，并且经过筛选，成为稳定表达FOXC1的细胞株，为后续实验提供了可靠的实验基础。

目前，FOXC1在肿瘤中的作用已成为研究热点，并已发现FOXC1在不同组织、器官的肿瘤发生发展中分别扮演了抑癌或致癌的角色。Wang等[10]研究显示在人基底样乳腺癌中FOXC1可以通过激活NF-κB信号通路促进体外癌细胞系的增殖、侵袭及迁移；并且FOXC1可以与VEGF通过Notch信号相互作用，从而调节血管基因的表达并诱导肿瘤血管生成。而Zhou等[11]的研究发现，TGF-β1可以通过上调FOXC1的表达从而负性调控多种肿瘤细胞的增殖，间接提示FOXC1可以抑制肿瘤的发生发展。该研究结果显示，通过慢病毒感染方式上调SKOV3细胞株中FOXC1的表达后，体外培养的SKOV3细胞增殖活性及侵袭能力受到了明显的抑制，但是具体机制仍不清楚。有研究[10-12]提示FOXC1在肿瘤中可能是通过NF-κB、VEGF/Notch、TGF-β/Smad、Wnt等多条细胞信号通路发挥作用。FOXC1发挥作用的同时可能伴随着多种调控方式及细胞信号转导通路的参与，不同状态下何种通路占优势可能会影响FOXC1在疾病中的作用。

综上所述，FOXC1的表达增高可抑制SKOV3细胞的增殖及侵袭。但该研究仅从体外实验分析了FOXC1过表达对SKOV3细胞系的某些生物学功能的影响，尚缺乏EOC更多细胞系的验证及相关的动物实验证实。随着对FOXC1在EOC体内实验及具体作用机制的深入探究，其有望成为EOC治疗中的有效靶点之一。

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[3]TÜMER Z,BACH-HOLM D.Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of PITX2 and FOXC1 mutations[J].Eur J Hum Genet,2009,17(12):1527

[4]RAY PS,BAGARIA SP,WANG J,et al.Basal-like breast cancer defined by FOXC1 expression offers superior prognostic value: a retrospective immunohistochemical study[J].Ann Surg Oncol,2011,18(13):3839

[5]XU Y,SHAO QS,YAO HB,et al.Overexpression of FOXC1 correlates with poor prognosis in gastric cancer patients[J].Histopathology,2014,64(7):963

[6]XIA L,HUANG W,TIAN D,et al.Overexpression of forkhead box C1 promotes tumor metastasis and indicates poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2013,57(2):610

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[8]VOGEL TJ,COHEN J,HAN B,et al.The role of FOXC1 in clear cell ovarian carcinoma: Potential prognostic biomarker for aggressive disease?[J].Gynecol Oncol,2015,139(1):204

[9]薛景戈,任琛琛,杨立,等.卵巢上皮性癌组织中IGF-1、E-cad蛋白的表达以及IGF-1对卵巢癌SKOV3细胞E-cad表达和侵袭力的影响[J].郑州大学学报(医学版),2016,51(3):396

[10]WANG J,RAY PS,SIM MS,et al.FOXC1 regulates the functions of human basal-like breast cancer cells by activating NF-κB signaling[J].Oncogene,2012,31(45):4798

[11]ZHOU Y,KATO H,ASANOMA K,et al.Identification of FOXC1 as a TGF-beta1 responsive gene and its involvement in negative regulation of cell growth[J].Genomics,2002,80(5):465

[12]SAVAGE J,VORONOVA A,MEHTA V,et al.Canonical Wnt signaling regulates Foxc1/2 expression in P19 cells[J].Differentiation,2010,79(1):31

(2016-11-18收稿 责任编辑徐春燕)

Impact of up-regulating FOXC1 expression on proliferation and invasion of SKOV3 cells

RENChenchen,LIUJiaxi,YANGLi,XUEJingge,LIFeiyan,LIULing,LIJing,BAIYang

DepartmentofGynecologyandObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

SKOV3 cell;FOXC1;proliferation;invasion

Aim: To explore the changes of proliferation and invasion in SKOV3 cells after up-regulating the expression of FOXC1. Methods: SKOV3 cells were divided into 3 groups: cells in experimental group were infected with p-EGFP-lentiviral vector with overexpressed FOXC1 plasmids, cells in vector control group were infected with empty p-EGFP-lentiviral vector, and cells in blank control group, not infected. The expressions of FOXC1 mRNA and protein were detected by qRT-PCR and Western blot,respectively. The cell proliferation after 24,48 and 72 h infection and cell invasion after 24 h infection were observed by CCK-8 kit and Transwell invasion assay,respectively. Results: The expressions of FOXC1 mRNA and protein in SKOV3 cells in experimental group were significantly higher than those in the vector control and blank control groups(P<0.05).Compared with blank control group and vector control group, the proliferation activity of SKOV3 cells in experimental group was reduced at different time points, so was the invasive ability(P<0.05).Conclusion: Up-regulation of FOXC1 may suppress cell proliferation and invasion of SKOV3 cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.008

*河南省科技厅科技攻关项目 162102310131

R737.31