西维来司钠联合脐带间充质干细胞移植对大鼠重型颅脑损伤的影响

苑国富，于兵，李顺宝

·基础研究·

西维来司钠联合脐带间充质干细胞移植对大鼠重型颅脑损伤的影响

苑国富1a，于兵1b，李顺宝2

目的：探讨西维来司钠联合脐带间充质干细胞（UCMSCs）移植对 SD 大鼠重型颅脑损伤的影响。方法：建立SD大鼠重型颅脑损伤模型，应用改良神经功能评分（mNSS）评价神经功能，纳入评分为12～16分（重度）的 SD大鼠60只。将其随机分为模型组（颅脑损伤组）、西维来司钠组、UCMSCs组、联合组（西维来司钠+UCMSCs），分别给予相应治疗。应用 Western-Blotting 和定量荧光 PCR 法检测各组大鼠损伤部位脑组织中脑源性神经营养因子（BDNF）的蛋白及mRNA表达变化；取各组大鼠损伤部位脑组织行HE 染色观察脑组织受损情况；免疫组化检测 BDNF的阳性表达。结果：治疗后各时间点，与模型组比较，西维来司钠组、UCMSCs组、联合组的评分下降，联合组的评分低于西维来司钠组及 UCMSCs组（P＜0.05）；联合组大鼠损伤部位脑组织中BDNF表达高于其他各组（P＜0.05）；联合组受损脑组织炎症浸润细胞明显减少，水肿程度明显减轻；联合组的 BDNF 阳性表达细胞多于西维来司钠组及 UCMSCs组（P＜0.05）。结论：西维来司钠联合UCMSCs移植可提高SD大鼠重型颅脑损伤后神经功能的恢复，能促进BDNF的表达。

西维来司钠；颅脑损伤；脐带间充质干细胞；BDNF；干细胞；移植；大鼠

重型颅脑损伤后会造成神经功能缺失和行为能力障碍，常留有后遗症[1-3]。目前临床上现有的治疗方法均不能达到满意的效果。因此，探讨重型颅脑损伤的有效疗法至关重要[4-6]。干细胞移植治疗脑损伤是近些年来的研究热点，脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）具有来源广泛、取材方便、无伦理争议等优点，其能通过促进各种营养因子的分泌保护受损的神经系统，在干细胞研究中备受关注[7,8]。研究发现，脑损伤过程中有炎症反应介导，中性粒细胞活化后可释放中性粒细胞弹 性 蛋 白 酶（neutrophil elastase，NE），NE等炎性细胞因子可触发血管炎性反应，参与颅脑损伤过程。西维来司钠是一种特异性NE抑制剂，可有效抑制NE的炎性反应，从而减轻重型颅脑损伤中的炎症反应，进而保护神经功能[9-12]。本研究探讨西维来司钠联合UCMSCs细胞移植对SD大鼠重型颅脑损伤的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级 1 月龄 SD 大鼠 65 只由河北医科大学动物实验中心提供[合格证号SCXK(冀)DK0390-0120]，体质量为 210～230 g，雌雄不限。保持良好的饲养环境，室温20 ℃～22 ℃，湿度50%左右，通风良好。喂养普通大鼠饲料及自来水，自由进食及饮水。实验操作过程中对动物处置方法符合动物伦理学要求。

1.1.2 主要试剂及设备 DMEM/F12 培养基（购于美国 Hyclone公司），胰蛋白酶（购于北京赛百盛基因技术有限公司），胎牛血清（购于美国 Gibco 公司），Western blot试剂盒、RT-PCR 试剂盒（购于美国Coulter公司），M-MLV 逆转录酶（购于美国 Biorad公司），10%水合氯醛（购于美国 Abcam 公司），抗BDNF抗体、兔抗鼠多克隆抗体（购于康为世纪生物科技有限公司），CY3 标记山羊抗兔 Ig G 抗体（购于武汉博士德生物技术有限公司），凝胶成像分析系统（购于美国 Alpha Innotech 公司），脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）（购于武汉博士德公司），石蜡切片机（购于上海徕卡仪器有限公司），荧光倒置显微镜（购于德国Heraeus公司），DAB显色试剂盒（购于北京中山生物技术有限公司），超净工作台（购于苏州安泰空气技术有限公司），CO2培养箱（购于长沙市长锦科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 UCMSCs 的 培 养 采 用 密 度 梯 度 离 心 法（1 500 r/min 离心 15 min）于无菌条件下，将所获足月胎儿脐带血进行体外分离 UCMSCs，用 1∶1PBS稀释采集的脐血，叠加于淋巴细胞分离液上，以2 000 r/min 密度梯度离心 20 min，收集白膜界面单个核细胞，以 1 000 r/min 离心 5 min，PBS 缓冲液冲洗 2 遍，弃去上清液。加入含体积分数为 15%的DMEM/F12 培养基，以 2×109/L 接种于 5 cm×5 cm 的培养瓶。37 ℃（含5%的CO2，饱和湿度）培养箱中培养，每天半量换液，72 h 更换培养基，去除未贴壁细胞，以后每隔 3 d 换液 1 次。观察细胞生长状况，待贴壁细胞融合 50%～80%后，细胞集落出现，2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，传代时按1∶3比例进行，倒置相差显微镜下每日观察细胞生长情况。使用 CD29（1∶300）、CD44（1∶200）、CD34（1∶200）抗体，对培养细胞进行组织化学染色鉴定，检测合格细胞用于实验移植。

1.2.2 大鼠重型颅脑损伤模型的建立及实验分组 采用液压冲击法建立大鼠重型颅脑损伤模型。以10%水合氯醛经腹腔麻醉后，按国际通用标准，对各组给予（364.77±16.21）kPa 峰值的冲击压力，建立重度颅脑损伤模型。造模成功建立后大鼠表现为去大脑强直和呼吸暂停，部分动物发生抽搐，短暂血压上升，伴心率减慢。对出现自主呼吸暂停的大鼠，即刻采用小动物呼吸机给予面罩吸氧。建模过程中死亡2只，改良神经功能评分（modified neurological severity score，mNSS）评 分 为 8～12 分 的3只大鼠被弃选，剩余评分为12～18分（重度）的60只纳入实验，随机分为模型组、西维来司钠组、UCMSCs组、联合组，每组各15只。模型组尾静脉注射细胞培养液；西维来司钠组尾静脉注射西维来司钠 30 mg/(g ·d)，UCMSCs组尾静脉注射 1.0×l09/L 的UCMSCs悬液 1 mL，联合组尾静脉联合注射西维来司钠 30 mg/ (g·d)+UCMSCs细胞悬液 1.0×l09/L。连续治疗 5 d。

1.2.3 神经功能评价 分别对各组大鼠在治疗前及治疗后 3、7、14、21 d 采用 mNSS 评价大鼠神经功能：总分为 18 分，正常为 0分，评分内容分为运动、感觉、平衡和反射4个部分，评分越低神经行为学功能越好，评分越高神经功能障碍越严重。

1.2.4 定 量 荧 光 PCR 法 检 测 各 组 大 鼠 损 伤 部 位 脑 组 织 中BDNF、NGF mRNA 的表达变化 建模后 2周，每组取 2只大鼠损伤部位脑组织，经 4 ℃离心 20 min，弃去上清，PBS 冲洗 3 次，通过 TRIzol法提取总 RNA，根据 PCR 试剂盒说明书将 RNA 逆转 录 为 cDRA。 扩 增 BDNF 和 内 参 GAPDH。 BDNF 上 游5’-CTCGAATTCCACCATGACCATCCTTTTCCTTA-3’，下游5’-CGCTCGAGAACATAAATCCACTAT CTTCCCCTF-3’，扩增产 物 为 124 bp。 GAPDH 上 游 ：5 ＇ -CACCTTTGATGCTGGGGCT＇，下游：5＇-GGTCCAGGGTTTCTTACTC-3＇，扩增产 物 为 130 bp。 PCR 反 应 条 件 ：95 ℃ 变 性 3 min，94 ℃ 变 性10 s，55 ℃ 退 火 30 s，72 ℃ 延 伸 30 s，40 个 循 环 ，72 ℃ 延 伸7 min。产物于 4 ℃保存。用 DNA 纯化试剂盒回收纯化凝胶内的BDNF基因产物。PCR产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用凝胶图像分析系统计算 GAP-43/NGF 产物与 GAPDH 产物的光密度积分的比值，作为 GAP-43/NGF-m RNA 的表达。

1.2.5 Western-Blotting 检测各组大鼠损伤部位 BDNF、NGF 蛋白的表达变化 将 RT-PCR 提取物进行离心，于 4 ℃下以1 200 rpm 速度离心 5 min，－20℃保存。取上清为粗提蛋白质，稀释终浓度为 0.5 mg/mL，采用 Bradford 法检测 BDNF 蛋白的浓度，以 5%浓缩胶 40 V 衡压 1 h，以 10%分离胶 60 V 恒压 3.5 h，湿转 14 V 恒 压 14 h，37 ℃ 下 摇 床 封 闭 2 h，洗 膜 3 次（每 次10 min）。加适当体积样品到 96 孔板的样品孔中，37 ℃封闭30 min。分别滴加 BDNF 一抗（1∶500），兔抗鼠多克隆抗体稀释溶于 TBST 中，4 ℃过夜，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min，滴加 CY3 标记二抗（1∶100，1%BSA-PBS 稀释）37 ℃孵育 30 min。PBS 冲洗3 次，每次 5 min，二甲基联苯胺（3,3-diaminobenzidine，DAB）显色。实验重复 3 次。采用 Quantity one软件分析 BDNF、NGF 条带与GAPDH条带吸光面积比值观察植入细胞BDNF表达情况。

1.2.6 HE 染色观察各组大鼠脑组织受损情况 建模后 2 周，每组取 2 只大鼠受损脑组织，经 40 g/L 多聚甲醛固定切片后，二甲苯对石蜡切片脱蜡，随后依次浸入梯度酒精（70%、80%、95%、无水酒精）中脱水。蒸馏水清洗切片 2 min，置于苏木素染液中10 min，再用蒸馏水清洗切片后，浸入梯度酒精，伊红酒精溶液染色后，用二甲苯透明。树胶封片，恒温箱中干燥后于显微镜下观察，并摄像。显微镜下每张切片于受损脑组织区取5个不重复视野，观察各组脑组织病理学形态变化。

1.2.7 免疫组化检测 BDNF 的表达情况 于建模后 2 周随机各组各取2只大鼠，10%水合氯醛经腹腔麻醉后处死大鼠，取受损脑组织，40 g/L 多聚甲醛灌注，固定 10 min，二甲苯对石蜡切片脱蜡，用无水乙醇对石蜡切片进行梯度水化，蒸馏水清洗，PBS冲洗 3 min，3%过氧化氢室温孵育 10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min，加热抗原修复 20 min，室温 冷 却 后 PBS 冲 洗 3 次 ，每 次 5 min。 免 疫 组 化 染 色 严 格 按BDNF 试剂盒说明操作，滴加 BDNF 一抗（1∶500）及兔抗鼠多克隆抗体稀释液内孵育，4 ℃过夜，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min，滴加CY3 标记二抗（1∶100，1%BSA-PBS 稀释）37 ℃孵育 60 min，弃掉 PBS液，每张切片加入 100 μL新鲜配制的DAB溶液，置于显微镜下观察 10 min，DAB 显色阳性为细胞核呈棕黄色。蒸馏水彻底清洗 3 次，每次 2 min，放入梯度酒精和二甲苯中脱水透明，切片风干，中性树脂封片。在高倍镜（×200）下每张切片上任取5个视野，荧光显微镜观察并计算BDNF阳性细胞数。

1.3 统计学处理

应用 SPSS 11.5 统计软件包分析数据，计量资料以（均数±标准差）（±s）表示，单因素方差分析、t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCMSCs的形态观察

原代培养的 UCMSCs细胞小而圆，悬浮状生长，培养5 d时UCMSCs散在分布培养瓶底，细胞呈纺锤形或椭圆形；首次更换培养液后，可见少量贴壁细胞，呈单个或几个细胞的克隆，有突起伸出；5～7 d出现大量贴壁细胞，集落数目明显增多，细胞体透亮；培养 10～14 d 时集落间渐融合成单层，集落细胞不断扩增。经多次传代，贴壁细胞均匀分布，UCMSCs呈放射状向周围扩展，漩涡状排列，均一性好，纯度≥97%，见图1。

2.2 各组大鼠的mNSS评分比较

图1 UCMSCs形态学观察（×200）

治疗前，各组大鼠的mNSS 评分差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后各时间点，与模型组比较，西维来司钠组、UCMSCs组、联合组的评分下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；联合组的评分低于西维来司钠组及UCMSCs组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 各组大鼠损伤部位脑组织中 BDNF mRNA 的表达变化

定量荧光PCR结果显示，联合组的BDNF mRNA表达高于其他 3 组，西维来司钠组及 UCMSCs组的 BDNF mRNA表达高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 2。

2.4 Western-Blot检测各组大鼠损伤部位 BDNF 蛋白的表达变化

各组大鼠损伤部位脑组织中的BDNF蛋白表达变化比较，联合组的损伤部位脑组织中的BDNF蛋白表达高于其他各组，西维来司钠组及UCMSCs组，西维来司钠组及UCMSCs组损伤部位脑组织中的BDNF蛋白表达高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3。

2.5 HE 染色观察各组大鼠脑组织受损情况

治疗14 d后，HE染色显示，模型组可见大量炎症细胞浸润、细胞呈明显水肿反应、间隙增大，有坏死、裂解细胞出现；西维来司钠组及UCMSCs组可见炎症细胞浸润有所减少，仍有部分水肿；联合组可见炎症浸润细胞明显减少，水肿基本消退，有瘢痕组织形成。各组间比较，联合组受损脑组织恢复程度明显优于西维来司钠组及UCMSCs组；西维来司钠组及UCMSCs组又较模型组明显好转。

2.6 免疫组化检测 BDNF 的阳性表达情况

免疫组化检测结果显示，在模型建立后 7 d 时 BDNF 阳性细胞达高峰后开始下降，而联合组 21 d 时仍有部分 BDNF 阳性细胞表达，联合组的BDNF阳性细胞表达多于其他各组，西维来司钠组及UCMSCs组BDNF阳性细胞表达多于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图 5。

表1 各组大鼠不同时间点的 mNSS 评分（分，±s）

表1 各组大鼠不同时间点的 mNSS 评分（分，±s）

注：与模型组比较，①P＜0.05；与西维来司钠组比较，②P＜0.05；与 UCMSCs组比较，③P＜0.05

组别模型组西维来司钠组UCMSCs组联合组只数15 15 15 15治疗前17.63±0.26 17.45±0.24 16.83±0.28 16.32±0.21治疗后3 d 16.58±0.32 15.31±0.31①14.77±0.28①14.26±0.33①②③治疗后7 d 15.78±0.24 13.57±0.27①12.80±0.30①10.13±0.28①②③治疗后14 d 14.36±0.17 11.58±0.13①10.21±0.15①8.31±0.14①②③治疗后21 d 12.51±0.18 8.36±0.11①7.45±0.09①4.02±0.06①②③

图2 RT-PCR 检测各组间 BDNF mRNA 的表达变化

图3 Western blotting 检测各组间 BDNF 蛋白的表达变化

3 讨论

目前临床上尚未研究出重型颅脑损伤有效的治疗方法[13,14]。大量研究表明干细胞移植可对脑损伤发挥较好的疗效，这为脑损伤后的治疗及修复提供了新思路[15,16]。随着对干细胞的深入研究发现，UCMSCs不仅具有神经元表面抗原，而且还能表达各种神经递质受体。其具有较骨髓源干细胞更多的优势，如分化能力更强、资源更丰富、排斥反应较轻、病毒感染风险低、无肿瘤细胞污染、对供者没有任何不良影响等，目前已成为备受关注的种子干细胞[17-19]。研究表明，UCMSCs单独移植的效果不是很理想，需结合生物工程材料及药物等手段进行综合治疗。

研究发现，西维来司钠可对脊髓、肝、心肌等再灌注损伤后的中性粒细胞炎性浸润发挥作用[20-22]。重症颅脑损伤后，炎性介质的级联反应可导致脑细胞结构功能广泛损伤，使血管内皮细胞、血管上皮细胞通透性增加，血管膜遭到破坏，进而加重颅脑损伤程度[23,24]。西维来司钠可有效抑制中性粒细胞激活后释放的NE，从而抑制NE介导的炎症反应，进而减轻炎症级联反应对颅脑的损伤[25-27]。目前尚未见有关西维来司钠联合 UCMSCs移植对重症颅脑损伤的研究，故本研究拟进行此实验，以期发现二者联合应用对重症颅脑损伤救治的价值[28-30]。

表2 各组BDNF阳性细胞表达比较（±s）

表2 各组BDNF阳性细胞表达比较（±s）

注：与模型组比较，①P＜0.05；与西维来司钠组比较，②P＜0.05；与 UCMSCs组比较，③P＜0.05

组别模型组西维来司钠组UCMSCs组联合组治疗后7 d 32.81±1.58 41.76±1.42①41.57±1.55①52.41±1.39①②③治疗后 14 d 30.42±1.28 35.74±1.86①36.65±1.79①45.36±1.83①②③治疗后21 d 12.21±2.08 19.13±2.32①19.34±2.27①34.75±2.18①②③

图4 HE染色观察各组大鼠脑组织受损情况（×200）

图5 各组 7 d 时免疫组化检测 BDNF 的阳性表达（×400）

本研究显示，在不同时间点联合组的mNSS评分低于西维来司钠组及UCMSCs组，表明UCMSCs联合应用西维来司钠后可更好地改善局部微环境，促进神经元功能的修复；联合组损伤部位脑组织中BDNF的表达优于西维来司钠组及UCMSCs组，表明UCMSCs在联合西维来司钠后更好地促进BDNF表达；HE染色观察到与模型组、西维来司钠组及UCMSCs组比较，联合组受损脑组织炎症浸润细胞明显减少，水肿程度明显减轻；免疫组化检测到BDNF的阳性表达在联合组显著多于西维来司钠组及UCMSCs组，二者联合应用的效果要明显优于单独应用。但因本研究资料及时间的局限性，对西维来司钠联合UCMSCs移植治疗的具体机制尚未明确，仍需进一步深入探讨。

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（本文编辑：王晶）

R741；R742

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.03.019

1.保定市徐水区人民医院 a.神经外科 b.急诊科河北 保定 072550 2.保定市第一中心医院心内科河北 保定 071000

2016-03-25

苑国富medicalthesis821@ 163.com