1071例地中海贫血基因筛查结果分析

陈育华++周碧云++梁斯锶++吴显劲++李海燕

[摘要]目的 了解來我院就诊的地中海贫血（简称“地贫”）筛查患者地贫基因类型并分析平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）在地贫筛查中的应用价值。方法 对2015年12月～2016年9月来我院就诊的1071例地贫筛查患者采用裂口PCR（gap-PCR）扩增法检测α地贫基因以及PCR-反向斑点杂交（PCR-RDB）技术检测β地贫基因，血细胞分析仪分析904例患者外周血的MCV、MCH。结果 ①1071例检测样本中男性556例，检出地贫230例（41.37%）；女性515例，检出地贫238例（46.21%），不同性别组检测阳性差异无统计学意义（χ2=2.55，P>0.05）。②儿童组（0～16岁）360例，检出地贫174例（48.33%）；青壮年组（17～49岁）651例，检出地贫278例（42.7%）；老年组（≥50岁）60例，检出地贫16例（26.67%），不同年龄组检测阳性差异有统计学意义（χ2=10.48，P<0.01）。③1071例样本共检测α地贫293例（27.36%），其中以αα/--SEA、-α3.7/αα、αα/-α4.2基因型为主，占α地贫的93.86%；检测β地贫157例（14.66%），其中以CD41-42、IVS-Ⅱ-654、-28、CD71-72、CD17基因型为主，占β地贫的82.81%；α地贫复合β地贫18例，比例为1.68%。④MCV用于α地贫、β地贫和αβ复合型地贫的筛查的灵敏度分别为91.18%、99.21%、92.31%，特异度为54.18%；MCH用于α地贫组、β地贫组和αβ复合型地贫组的筛查的灵敏度分别为94.12%、99.21%、100.00%，特异度为51.90%；MCV+MCH用于α地贫组、β地贫组和αβ复合型地贫组的筛查的灵敏度分别为89.08%、99.21%、84.62%，特异度为49.24%；MCV与MCH的灵敏度差异无统计学意义（χ2=1.77，P>0.05），特异度差异无统计学意义（χ2=0.55，P>0.05）。结论 1071例地贫患者中α地贫中以αα/--SEA基因型最为常见，β地贫中以βCD41-42基因型最为常见，在地贫筛查中，MCV+MCH用于筛查效果好。

[关键词]α地中海贫血；β地中海贫血；平均红细胞体积；平均红细胞血红蛋白含量

[中图分类号] R556.71 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）04（c）-0159-05

[Abstract]Objective To investigate the genetic heterogeneity of thalassemin of patients in our hospital

and the diagnostic value of mean corpuscular volume（MCV） and mean corpuscular hemoglobin （MCH）in thalassemia screening.Methods From December 2015 to September 2016，1071 patients with thalassemia in our hospital were selected，gap-PCR and polymerase chain reaction-reverse dot blot （PCR-RDB） were used to test α-thalassemia gene and β-thalassemia gene，hematology analyzer was used to test mean corpuscular volume （MCV） and mean corpuscular hemoglobin （MCH） of 904 patients.Results ①Among the 1071 cases，556 cases was male and 515 cases was female，the positive rate of thalassemia was 41.37%（230 cases） for male and 46.21%（238 cases） for female，which was displayed no statistical differences in the two groups （χ2=2.55，P>0.05）.②During different group such as children group （0-16 years old，360 cases），adult group （17-49 years old，651 cases） and senior group （≥ 50 years old，60 cases），the positive rate of thalassemia was 48.33%（174 cases），42.7%（278 cases） and 26.67%（16 cases），respectively，which was displayed statistical differences among the groups （χ2=10.48，P<0.01）.③among 1071specimens，293 cases （27.36%） were diagnosed as α-thalassemia and 157 cases （14.66%） were diagnosed as β-thalassemia.Among the α-thalassemia genotypes，αα/--SEA，-α3.7/αα，αα/-α4.2 were the most common genotypes （93.86%）；among the β-thalassemia genotypes，CD41-42，IVS-Ⅱ-654，-28，CD71-72，CD17 were the most common genotypes （82.81%）；18 cases （1.68%） were diagnosed as α- thalassemia combined with β-thalassemia.④The diagnostic sensitivity of MCV for α-thalassemia，β-thalassemia and αβ-thalassemia screening were 91.18%，99.21% and 92.31%，respectively，and 54.18% for the diagnostic specificity.The diagnostic sensitivity of MCH for α-thalassemia，β-thalassemia and αβ-thalassemia screening were 94.12%，99.21% and 100.00%，respectively，and 51.90% for the diagnostic specificity.The diagnostic sensitivity of MCV+MCH for α-thalassemia，β-thalassemia and αβ-thalassemia screening were 89.08%，99.21% and 84.62%，respectively，and 49.24%% for the diagnostic specificity.There was no significant difference in the sensitivity and specificity between MCV and MCH （χ2=1.77，P>0.05；χ2=0.55，P>0.05）.Conclusion αα/-SEA genotype and βCD41-42 genotype are the most common type in α-thalassemia and β-thalassemia in 1071 patients with thalassemia，it is reasonable to screening the thalassemia by MCV combine with MCH.

[Key words]α-thalassemia；β-thalassemia；Mean corpuscular volume；Mean corpuscular hemoglobin

地中海贫血（简称“地贫”）又称海洋性贫血或珠蛋白合成障碍性贫血，是一种常染色体隐性的单基因遗传病[1]。由于珠蛋白基因缺陷导致血红蛋白中的珠蛋白肽链合成减少或不能合成，使得血红蛋白的组分和含量发生改变，影响到红细胞的携氧能力，从而导致不同程度的溶血，使患者发生贫血，其中以α和β地贫较为常见[2]。据WHO估计，世界人口约有4.5%的人群携带有地贫基因[3]，在中国主要集中在长江以南的福建、江西、湖南、广东、广西、海南、重庆、四川、贵州、云南等省（市、自治区），尤其以两广地区最为严重。广东地贫基因携带者超过10%，广西地贫基因携带者超过20%，目前世界上还没有治疗地贫的有效方法，所以预防地贫儿的出生尤为重要[4-9]。本研究分析来我院就诊的地贫筛查患者的地贫基因类型并分析平均红细胞体积（mean corpuscular volume，MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）在地贫筛查中的应用价值。

1对象与方法

1.1对象

选择2015年12月～2016年9月于我院进行地贫基因检测的患者1071例，以MCV<80 fl和（或）MCH<27 pg者为筛查阳性，对筛查阳性患者再进行地贫基因检测。本研究经医院医学伦理委员会批准，参与研究者均签属知情同意书。其中男性556例，女性515例；按年龄分为儿童组（1～16岁）360例，青壮年组（17～49岁）651例，老年组（≥50岁）60例。

1.2仪器与试剂

血细胞分析仪（LH750）为美国贝克曼库尔特公司产品，试剂为产家原装配套试剂。PCR扩增仪（Hema 9600）为贝登生物科技有限公司产品，地贫基因检测试剂盒由深圳亚能生物技术有限公司提供。

1.3检测方法

1.3.1血细胞分析 用EDTA抗凝管抽取2 ml静脉血，直接将样本在血细胞分析仪上检测，主要观察指标为平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）。

1.3.2地贫基因分析 用EDTA抗凝管抽取3 ml静脉血，按照亚能生物公司核酸提取试剂盒说明书提取全血DNA。α地贫基因PCR扩增：取2 μl DNA加入反应管中（反应总体系为25 μl），先96℃加热5 min，然后98℃ 45 s，65℃ 90 s，72℃ 3 min共10个循环，再98℃ 30 s，65℃ 45 s，72℃ 3 min，共25个循环，最后72℃ 10 min。取PCR产物及示踪染料各1 μl混匀后，1.0%琼脂糖凝胶电泳60 min，电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入紫外透射分析仪上观察α地贫缺失类型。β地贫基因PCR扩增：取2 μl DNA加入反应管中（反应总体系为25 μl），先50℃加热15 min，然后95℃加热10 min，再94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 30 s共35个循环，最后72℃ 10 min，将PCR产物与试剂盒膜条进行杂交，然后洗膜、显色，肉眼观察β地贫突变位点类型。

1.3.3各指标的计算方法 真阳性者（TP）：初筛阳性而地贫基因阳性患者；假阳性者（FP）：初筛阳性而地贫基因阴性患者；真阴性者（TN）：初筛阴性而地贫基因阴性患者；假阴性者（FN）：初筛阴性而地贫基因阳性患者；灵敏度=[TP/（TP+FN）]×100%；特异度=[TN/（TN+FP）]×100%；阳性预测值=[TP/（TP+FP）]×100%；阴性预测值=[TN/（TN+FN）]×100%；准确度=[（TP+TN）/（TP+FP+TN+FN）]×100%。由于患者没有进行血红蛋白（Hb）电泳分析，而MCV、MCH仅为地贫筛查的初级筛查指标，因此本次的特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度仅针对总的地贫基因筛查进行统计。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 1071例地貧患者地贫基因型的分布情况

2.1.1 1071例检测样本中按性别和年龄分组的结果分析 1071例检测样本中，男性检出地贫基因230例（41.37%），女性检出地贫基因238例（46.21%），男、女地贫基因检测阳性差异无统计学意义（χ2=2.55，P>0.05）；儿童组检出地贫基因174例（48.33%），青壮年组检出地贫基因278例（42.7%），老年组检出地贫基因16例（26.67%），不同年龄组地贫基因检测阳性差异有统计学意义（χ2=10.48，P<0.01）。

2.1.2 1071例检测样本中按地贫基因类型的结果分析 1071例检测样本中，确诊为α地贫293例（27.36%），包括5种基因亚型，其中以αα/--SEA（174例，59.39%）、-α3.7/αα（72例，24.57%）、αα/-α4.2（29例，9.90%）基因型为主，占总体α地贫的93.86%（表1）；确诊为β地贫157例（14.66%），包括15种基因亚型，其中以CD41-42（37.58%）、IVS-Ⅱ-654（22.30%）、-28（10.83%）、CD17（8.92%）、CD71-72（3.18%）基因型为主，占总体β地贫的82.81%（表2）；确诊为α地贫复合β地贫基因型18例（1.68%），包括11种复合基因亚型（表3）。

2.2 MCV、MCH在地贫筛查中的价值

本次确诊α地贫、β地贫以及α地贫复合β地贫分别为238、127、13例，未检出地贫基因526例。在三种地贫基因筛查阳性例数中，MCV阳性例数分别为217、126、12例，MCH阳性例数分别为224、126、13例，MCV+MCH阳性例数分别为212、126、11例，MCV、MCH、MCV+MCH三个指标在地贫基因筛查的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度见表4。应用统计学软件进行分析，MCV与MCH的灵敏度差异无统计学意义（χ2=1.77，P>0.05），特异度差异无统计学意义（χ2=0.55，P>0.05）。

3讨论

地贫一旦发病，不仅会给患者自身的身心健康带来严重的危害，也会给社会及患者家庭带来沉重的精神负担和经济负担[10]。在地贫较为流行的国家和地區，地贫已经成为一个重大的公共卫生问题。在现有的技术条件下，地贫一旦发生尚没有办法根治，只能依靠规范的产前筛查和诊断，有效地预防和控制地贫的发生，及时发现可能出生的中重型地贫患儿并终止妊娠[2]。地贫检测的方法包括血液学进行初筛和基因诊断进行确诊[11]。血液学进行初筛，主要是通过血常规指标血红蛋白含量、MCV、MCH等，结合血清铁检测和血红蛋白电泳分析可初步筛查出地贫患者，基因诊断主要依靠分子生物学手段检测基因的缺失及突变[12]。

本研究检测的1071例地贫患者中，检出地贫基因携带者468例，阳性率达到43.70%，反映出本地区是地贫的高发区，应加强本地区地贫的筛查和基因诊断以检出携带者，同时开展人群普查和遗传咨询、做好婚前指导以避免地贫基因携带者之间联姻，这对于预防本病有重要意义。本次确诊为α地贫患者293例（27.36%），其中以αα/--SEA、-α3.7/αα、αα/-α4.2基因型为主，占总体α地贫的93.86%。其中以αα/--SEA（59.39%）占多数，其基因型与东莞、深圳、广州地区的基因型相同，与广东、广西、湖南、四川、江西等省人群中缺失型α地贫常见基因型相同[13-16]。另外β地贫检出157例（14.66%），以CD41-42（-TCTT）（37.58%）占多数，其次为IVS-Ⅱ-654（C→T）（22.30%），这与东莞、深圳的β地贫基因型突变类型一致，而重庆、云南地区的β地贫基因型突变类型以CD17（A→T）最多，其次为CD41-42（-TCTT）、IVS-Ⅱ-654（C→T）[17-18]；广东、广西β地贫基因型突变类型以CD41-42（-TCTT）最多[4，13]，这表明不同地域和不同人群的β地贫基因突变谱的构成也不尽相同[19]。

本研究还发现，MCV或MCH作为地贫筛查的指标，其灵敏度可达90%以上，但特异性偏低，分别为54.18%、51.90%、49.24%，主要是由于其他一些小细胞低色素性贫血的干扰所致，其中以缺铁性贫血最为常见，临床上可以通过测定血清铁蛋白加以鉴别诊断[1]。此外，本实验室只检测3种常见缺失型α-地贫基因（--SEA、-α3.7、-α4.2），对于少见的缺失型α-地贫基因[--THAI，--FIL，--MED，-（α）20.5]以及非缺失型α-地贫基因（αCSα、αQSα及αWSα）没有检测，这也是导致初筛特异性偏低的原因之一[20]。也有研究表明[16]，当MCV、MCH均下降，HbA2>4.0%时，应高度怀疑β地贫，因此继续探讨HbA2、MCV+MCH+HbA2联合方案对临床的应用价值，值得进一步研究。

综上所述，对于地贫基因的初筛，不管是一级筛查还是二级筛查，都有漏检的可能性。在临床工作中，尤其是优生遗传咨询的医生，对于有地贫家族史且有血液学表型异常但常规基因检测又未见异常的标本，需告诉检测者要进一步采用基因测序等技术进一步确诊，以提高地贫基因携带的检出率及准确性，减少因漏检及假阳性给家庭和社会带来的危害。

[参考文献]

[1]陈亦明，杨图深，王长金，等.应用红细胞平均体积筛查无偿献血者携带地贫基因的价值[J].现代医院，2012，12（2）：60-61.

[2]张小庄，冯占春，叶宁.地中海贫血的预防控制[M].北京：人民卫生出版社，2014：1-2.

[3]刘兴梅，李贵芳，吴娴，等.贵州165例α-地中海贫血基因突变类型初步分析[J].重庆医学，2015，44（17）：2146-2418.

[4]林慧，段金良.广西不孕症妇女α和β地中海贫血的基因鉴定[J].中国优生与遗传杂志，2016，24（1）：47-48.

[5]张玲，韩坤，胡朝晖，等.广州地区528例珠蛋白生成障碍性贫血患者的ABO血型分布[J].检验医学与临床，2016， 13（2）：228-229.

[6]林金瑞，李介华，黄振勇，等.清远地区CD41-42β地中海贫血人群基因型组合特点及红细胞参数特点分析[J].广东医学，2015，36（3）：410-413.

[7]姜碧，姚倩瑜，韦思似，等.东莞地区孕前优生健康枪柄夫妇地中海贫血结果分析[J].中国妇幼保健，2016，31（7）：1475-1477.

[8]姜碧，钟鸣，韦思似，等.东莞地区育龄人群α地中海贫血分子流行病学调查[J].中国优生与遗传杂志，2015，23（7）：22-23.

[9]陈淑芬，赡淑莉，宋春林，等.佛山地区非缺失型α地中海贫血基因突变分析[J].中国优生与遗传杂志，2015，23（3）：17-22.

[10]陈宜升，蔡桂花，孙玉红，等.潮州地区7293例新生儿α-地中海贫血筛查分析[J].中国优生与遗传杂志，2016， 24（1）：88-85.

[11]林金端，李介华，黄振勇，等.地中海贫血初筛表型阴性的育龄人群基因检测结果分析[J].广东医学，2014，35（24）：3836-3837.

[12]杜伟，欧阳小峰，甘承文，等.重庆地区8024例地中海贫血筛查结果及地贫基因型分析[J].重庆医科大学学报，2014，39（5）：694-697.

[13]王晶晶，朱文彪，黄霜，等.广州市1381例育龄人群地中海贫血基因谱分析[J].中国优生与遗传杂志，2015，23（2）：5-7.

[14]田玉玲，雷力民，黄伟.2650例育龄期妇女地中海贫血的筛查结果分析[R].重庆医学，2014，43（31）：4232-4234.

[15]钟鸣，姜碧，刘惠，等.东莞地区26906对育龄夫妇地中海贫血筛查结果分析[J].中国优生与遗传杂志，2015，23（5）：25-26.

[16]郑琳，黄海龙，范向群，等.血细胞和血红蛋白分析在地中海贫血中的应用价值[J].中国妇幼保健，2016，31（3）：547-549.

[17]李良琼，熊见，王长本，等.渝东北区地中海贫血常见基因类型的调查研究[J].国际检验医学杂志，2015，36（6）：753-757.

[18]张杰，贺静，曾小红，等.云南省人群地中海贫血遗传多样性的研究[J].昆明医科大学学报，2016，37（1）：28-34.

[19]陈兴，肖奇志，于雯，等.应用探针熔解曲线分析技术快速检测非缺失型α-地中海贫血[J].国际检验医学杂志，2015，36（14）：2009-2014.

[20]唐海深，万志丹，张艳芳，等.2例未知基因型地中海贫血的产前诊断[J].中国计划生育和妇产科，2017，9（2）：64-67.

（收稿日期：2017-03-15 本文编辑：任 念）