猪伪狂犬病病毒高免血清的制备及应用

王玉玲福州大北农生物技术有限公司福州350014

猪伪狂犬病病毒高免血清的制备及应用

王玉玲福州大北农生物技术有限公司福州350014

用伪狂犬病病毒及抗体阴性羊，以不同免疫剂量，间隔一定时间，多次免疫不同类型的猪伪狂犬病病毒（Bartha-K61株），制备猪伪狂犬病病毒高免血清，特异性强，效价可达1:2 048以上。本研究为伪狂犬病活疫苗或毒种的鉴定及外源病毒检验提供了具有良好特异性和高效价的中和用血清。

猪伪狂犬病病毒高免血清ELISA中和试验外源病毒检验

伪狂犬病（Aujeszky's Disease）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus PRV）引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要特征的一种重要传染病。该病自1902年发现以来，已在全球范围内流行。中国自1947首次报道以来，目前已扩大到全国各地，隐性感染、临床发病及混合感染日趋严重，每年因为该病造成巨大经济损失。进行疫苗接种是预防、控制甚至消灭伪狂犬病最主要的措施之一。

根据《中国兽药典》三部（二〇一〇年版）规定，伪狂犬病活疫苗或毒种必须进行外源病毒检验，此项检验需用抗PRV特异性血清对样品进行中和。因此，抗血清的中和效价和特异性对检验起着至关重要的作用。由于市场上缺乏能够满足兽用生物制品生产企业检验需求的伪狂犬病特异性抗血清，因此，本研究优化了免疫条件，利用伪狂犬病活疫苗进行基础免疫，并用伪狂犬病灭活疫苗进行加强免疫，对所收集的血清进行纯净性、中和效价和中和能力进行鉴定，从而制备了一批特异性较强的抗PRV高免血清，为开展伪狂犬病活疫苗或毒种的外源病毒检验提供了物质保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 免疫抗原猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株，效价为105.5TCID50/头份），由福州大北农生物技术有限公司生产。猪伪狂犬病灭活疫苗（Bartha-

K61株，灭活前病毒含量为106.5TCID50/0.1 mL），由试验组自制。

1.1.2 试验动物5只健康豚鼠（350~400 g）；选取10只3~6月龄健康山羊，采血，进行细胞中和试验和ELISA检测，确定伪狂犬病病毒及抗体均为阴性，且羊类相关抗原及抗体均为阴性。

1.1.3 试验仪器和试剂Marc-145细胞、PK15、ST细胞和Vero细胞等由福州大北农生物技术有限公司质检部提供；SPF蛋购自济南斯帕法斯；羊痘、小反刍兽疫病毒，蓝舌病、口蹄疫等ELISA抗体检测试剂盒购自美国BD公司；BVDV间接免疫荧光检测试剂盒，PPV间接免疫荧光检测试剂盒，CSFV间接免疫荧光检测试剂盒购自中国兽医药品监察所；BVDV抗体检测试剂盒购自韩国金诺公司；伪狂犬病抗体检测试剂盒（gE、gB）购自IDEXX公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫程序对购入山羊进行采血，采用细胞法进行伪狂犬病病毒检测为阴性，用细胞中和法和ELISA测定伪狂犬病抗体为阴性，观察1周进行采血作为阴性对照。将10只羊分为2组，5只/组，具体接毒过程和间隔时间见表1。

1.2.2 高免血清的制备和安全性试验当用ELISA方法检测血清抗体效价达到要求(1:2 048)时，对山羊进行无菌采血，采得的血液均用自然凝结法分离血清，56℃灭活30 min后，少量分装并标记后-40℃保存备用。将自制血清样品，分别给5只健康豚鼠进行皮下注射1 mL，观察豚鼠反应。

1.2.3 纯净性检验根据《中华人民共和国兽药典》及《中国生物制品检验规程》进行无菌检验、支原体检验、内毒素检验、外源病毒检验。

1.2.4 高免血清效价测定

1.2.4.1 细胞法测定将血清按2倍倍比稀释，将工作抗原用M199稀释成100TCID50/0.1 mL的伪狂犬病病毒液与各稀释度血清样品等量混合，摇匀后在37℃中和1 h，其间振摇3次。同时设正常细胞组、工作抗原100TCID50/0.1 mL浓度加等量Hank's液的病毒对照组，中和结束分别接种鸡胚成纤维细胞，每个稀释度5孔（96孔板），每孔0.2 mL，37℃温箱中孵育1 h后弃去上清液，加入含1%NBS的M199营养液，0.2 mL/孔，37℃、5%CO2培养箱中培养观察5 d，观察细胞病变情况，计算血清中和效价。

1.2.4.2ELISA方法测定取最终所采血清按2倍倍比稀释，后根据伪狂犬病病毒抗体检测试剂盒操作说明进行操作，测定OD值，计算血清中和效价。

1.2.5 初步应用按照《中国兽药典》三部(二〇一五年版)，应用本研究制备的抗PRV高免血清，进行PRV种毒中和试验和伪狂犬病活疫苗外源病毒检验。

1.2.5.1PRV种毒中和试验取效价为106.5TCID50/ 0.1 mL的种毒，将不同量的血清样品（0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL）分别与0.1 mL病毒液混合，37℃中和1 h，分别接种鸡胚成纤维细胞，观察7 d，观察细胞病变情况，如无病变将细胞瓶反复冻融后进行继代，三次继代均无病变，则判定为中和完全。

1.2.5.23 批伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）外源病毒检验取3批伪狂犬病活疫苗分别稀释成10头份/2 mL，12 000 r/min降温离心15 min后取上清，将不同量的血清样品（0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、 2.0 mL）按照病毒效价与病毒抗原混合，37℃中和1 h后接种T25的Vero细胞，ST细胞单层，每瓶接种血清和抗原混合液（保证抗原量为10头份），37℃孵育1 h后，弃去上清液，用无血清DMEM培养基洗涤2次后加入含2%NBS的DMEM培养液10 mL，37℃、5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变情况，5 d后取出细胞瓶置于-40℃反复冻融3次，12 000 r/min降温离心5 min后取上清，进行继代培养。5 d后-40℃反复冻融3次，离心取上清接种Vero细胞，ST细胞单层，进行第二次继代培养，观察细胞病变情况，经3次培养如未发现细胞病变判定为中和完全。

2 结果

2.1 中和抗体效价测定

2.1.1 细胞中和法结果见表2。

表1 免疫程序

表2 细胞中和法测定中和抗体效价结果

2.1.2ELISA方法结果见表3。

从表2-表3可以看出，用细胞中和法和ELISA方法测定的抗体效价结果基本一致，且免疫方法B的免疫效果较方法A的免疫效果有明显差异。说明采用活疫苗与灭活疫苗协同作用的效果较单独使用灭活疫苗的免疫效果要好。

表3ELISA方法测定中和抗体情况

2.2 安全性检验血清注射豚鼠后观察10 d，豚鼠均健康，无异常表现。

2.3 纯净性检验经检验样品中无细菌、霉菌、支原体生长，外源病毒检验结果为合格。

2.4 初步应用

2.4.1PRV种毒中和试验中和试验结果表明，本研究制备的1 mL抗PRV血清可完全中和106.5TCID50的病毒。

2.4.23 批伪狂犬病活疫苗外源病毒检验3批疫苗样品的外源病毒检验结果均为阴性，说明2 mL抗PRV血清完全可以中和10头份效价≤106.0TCID50/头份的疫苗样品。结果见表4。

3 讨论

表4 血清中和能力测定结果

按照《中国兽药典》三部（二〇一〇年版）要求，猪伪狂犬病活疫苗或毒种必须进行外源病毒检验。外源病毒检验需使用一定量的血清与相当于10头份的猪伪狂犬病活疫苗或毒种进行中和，这要求抗血清应具有良好的特异性和高效价。

本实验室根据多次试验的经验，优化了免疫方法，最终制备了2 000 mL抗血清。按照《中国兽药典》三部（二〇一〇年版）对血清进行了无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，结果均符合规定，确保了血清的纯净性。

本研究在首次免疫前对使用的山羊进行了血清抗体筛查，确保无外源病毒感染。为了提高抗血清的中和效价，本研究采用活疫苗进行基础免疫，然后用灭活疫苗间隔不同时间进行多次加强免疫，促使机体免疫系统持续产生高效价的抗体。血清中和效价最高可达1:4 096，1 mL中和抗体效价为1:2 048的血清可中和效价为106.6TCID50的伪狂犬病病毒。应用于外源病毒检验时，3批疫苗样品的病毒含量分别为105.2TCID50/头份、105.5TCID50/头份、106.0TCID50/头份，2 mL抗PRV血清能够完全中和10头份效价≤106.0TCID50/头份的疫苗样品。

从试验结果可以看出，采用本试验的免疫方法可制备出高效价的猪伪狂犬病病毒高免血清，该血清完全满足伪狂犬病活疫苗的外源病毒检测的使用要求，同时该血清也完全可以用于各大猪场及研究机构用于伪狂犬病病毒的检测及抗原检测试剂盒的研制。因此，本试验的内容具有较高的应用价值。

[1]Aersham pharmacia biotech.Bulk and Redipack GST expression modules[M].2001:1-18.

[2]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997: 998-1009.

[3]孔令达.我国伪狂犬病现状及伪狂犬病疫苗的应用[J].养猪,2000(1):39-40.

[4]张雪云.猪伪狂犬病诊断方法研究进展[J].哈尔滨师范大学学报:自然科学版,2014,30(1):71-75.

[5]刘涛,赵京媛,孙晓成.猪伪狂犬疫苗研究进展[J].兽医导刊, 2012(12):72-74.

The preparation and application of porcine pseudorabies virus high immune serum

Wang Yuling
（Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.,Fuzhou 350014）

This study produced the pseudorabies virus(PRV)high immune serum by multi-incubated the pseudorabies antibody negative healthy goat with pseudorabies vaccine strain Bartha-K61 with different doses at certain intervals,and identified the high immune serum by neutralization test and ELISA.The results approved that the PRV high immune serum produced by this method is of high specification,the titer is not less than 1:2 048.Antiserum against PRV was prepared with high specificity and neutralization titer for the identify inspection and exogenous virus test of PR live vaccines and virus seeds．

Pseudorabies virus High immune serum ELISA Neutralization test Exogenous virus test

A

1003-4331（2017）03-0004-04