老年高血压患者肝肾阴虚证的特征

白玲玲，仲茂凤，杜娟，凌昌全

第二军医大学中医系,上海200433

老年高血压患者肝肾阴虚证的特征

白玲玲，仲茂凤，杜娟，凌昌全

第二军医大学中医系,上海200433

目的观察老年高血压患者肝肾阴虚证临床特征及外周血标识基因表达，为中医辨证论治老年高血压提供依据。方法本研究首先分析老年高血压患者高血压分级和病程与肝肾阴虚证的相关性；再根据全基因组芯片在原发性肝癌患者的肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证组中筛选的具有差异表达的17个基因mRNA的表达，基于异病同证原理，应用实时荧光定量PCR技术探索性观察老年高血压肝肾阴虚证患者的外周血单个核细胞中是否存在同样的17个差异基因mRNA的表达。并应用受试者特征性操作曲线（ROC曲线）构建肝肾阴虚证的诊断模型。结果研究共纳入老年高血压患者（＞65岁）60名，其中肝肾阴虚证患者30名，非肝肾阴虚证患者30名，随着高血压病程延长，老年高血压肝肾阴虚证患者更多；与非肝肾阴虚证患者相比，老年高血压肝肾阴虚证患者外周血单个核细胞中MLH3表达减少，CD55表达增加，差异具有统计学意义，进一步采用ROC分析，AUCMLH3=0.783，AUCCD55=0.737，MLH3和CD55作为老年高血压肝肾阴虚证诊断模型的灵敏度分别为63.5%、57%，特异度分别为93%，90%。结论MLH3和CD55可能是老年高血压肝肾阴虚证的标识基因。

老年；高血压；肝肾阴虚证；错配修复基因3；促衰变因子

随着老龄化社会的到来，老年高血压患者的数量近年来也持续增多，长期服用降压药物及高血压所带来的并发症，严重影响了患者的生活质量，尤其是老年高血压患者[1]。有报道，高血压发病率随年龄增长而增加[2]。高血压在传统祖国医学中属于“眩晕”、“头痛”、“中风”、“痰饮”、“水肿”、“耳鸣”等疾病范畴，其病理机制与肝、肾相关，多肝肾阴虚表现，这一点最早可追溯至《黄帝内经》[3]成书时期。现代著名医家郭士魁[4]对原发性高血压的发病认为是“肝火可见于高血压初期，热证时久必损阴液形成阴虚阳亢，病情再发展，阴虚更甚，肾阴虚影响到肝阴虚，出现肝肾阴虚。”由于老年人的生理机能特点，肝肾阴虚证在老年高血压患者中更为多见，接近17%的老年高血压患者表现为肝肾阴虚[5]。本文基于“异病同治”的思想，在既往 mRNA芯片筛选出的肝癌肝肾阴虚标识基因的基础上，对老年高血压患者肝肾阴虚进行临床症状分析，并探讨其可能的物质基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 60例病例来源2013年1月—2015年2月期间就诊于第二军医大学附属长海医院心内科、上海市中医医院心内科和上海龙华医院的高血压患者。按照中医辨证 [辨证标准参考2002年版《中药新药临床研究指导原则 (试行)》]，分为肝肾阴虚组30例和非肝肾阴虚组30例。

1.2 诊断及分级标准 参照《中国高血压防治指南》2010年修订版[6]制定的诊断标准:（1）年龄＞65岁、血压持续或 3次以上非同日坐位血压收缩压＞l40 mmHg和（或）舒张压＞90mmHg。（2）l级高血压收缩压：140～159mmHg和（或）舒张压90～99mmHg；2级高血压:收缩压160～179 mmHg和（或）舒张压100～109 mmHg。(当收缩压与舒张压属不同分级时,按较高的级别诊断)。辨证标准:参照国家药品监督管理局2002年制定发布的《中药新药临床研究指导原则》[7]按症状分级量化标准采样归纳。

1.3 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离及RNA抽提采集每例患者外周血3m L，EDTA抗凝，PBS稀释，缓慢加入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，3 000 g离心30 min；分离PBMCs，加入Trizol，按照5:1的体积加入氯仿，室温静置，离心，提取上层水相，等体积加入异丙醇，离心，提取总RNA[8-9]。

1.4 RTPCR检测参照文献[10]，将提取的RNA反转录为cDNA，加入引物（见表1），SYBRGreen，ddH2O补足体积，配成20L反应体系，进行定量PCR检测。

1.5 统计学分析 所有数据运用IBM SPSS Statistic17.0进行统计，数据呈现形式以平均值±标准差为主,组间基因相对表达差异的比较，选用检验，统计结果以＜0.05为有统计学意义。对上述筛选的阳性差异表达基因，以非参数法构建各自的受试者工作特征ROC曲线，计算曲线下面积 (Area under the Curve of ROC,简称AUC)，从而构建肝肾阴虚证的诊断模型。＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列

2 结果

2.1 老年高血压患者肝肾阴虚证的临床特点 在肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证患者中，依据高血压诊断标准中的分级标准，2组患者中诊断为高血压1级的各1例，高血压2级的分别为8例和10例，诊断为高血压3级的分别为20例和19例。见表2。

表2 高血压分级与证候

对入组患者原发性高血压发病病程进行了统计，并以＜5年、5～10年、11～15年、＞15年4个不同阶段进行分层，发现随着老年患者病程的延长，表现为肝肾阴虚者更多。见表3。

表3 高血压病程与证候

2.2 老年高血压患者肝肾阴虚证的标识基因 既往采用mRNA芯片筛选肝癌患者肝肾阴虚证标识基因，发现表达下调的是：SEC62、ACSL6、PDE3B、BIRC3、TCF7、CR1、CCNB1、PAICS、PSPH、CD55、NT5E和MLH3（＜0.05）；表达上调的是PSMD6、KRAS、TRPC1、CTSK和XRCC4（＜0.05）；根据“异病同证”思想，其他疾病肝肾阴虚证患者可能存在相同的物质基础，检测这17个基因在老年高血压肝肾阴虚证患者的表达，结果发现，与非肝肾阴虚证组相比，肝肾阴虚证患者外周血单个核细胞中仅有MLH3表达下调（＜0.05），CD55表达上调（＜0.05）。其余基因的表达2组间差异无统计学意义。见图1。

图1 17个基因在老年高血压肝肾阴虚证组与非肝肾阴虚证组的表达

2.3 构建老年高血压患者肝肾阴虚证证候诊断模型 根据 MLH3和 CD55的受试者特征曲线，AUCMLH3=0.783,AUCCD55=0.737，MLH3和 CD55作为老年高血压肝肾阴虚证诊断模型的灵敏度分别为63.5%和57%，特异度分别为93%和90%。见图2。

图2 MLH3和CD55的ROC曲线

3 讨论

高血压病按其临床表现可归属于祖国医学“眩晕”、“头痛”等范畴。老年高血压病是高血压病的一种特殊类型，其临床表现多样，病因病机复杂，发病与脏腑功能虚损的关系极为密切。肝肾亏虚、阴阳失调，是为本虚；肝阳上亢、痰浊闭阻，是为标实。卢灿辉总结卢永兵治疗老年高血压病经验，认为老年高血压是虚实夹杂、上实下虚之病，初病常以实为主，病久以虚为主，虚以肝肾阴虚、心脾气虚多见，实以风、火、痰、疲为主[11]。本研究的结果也正说明这一点,随着患者年龄的增长及病程的延长，患者证型多呈现出由实证向虚证转化的趋势。高血压病程较长的患者表现为肝肾阴虚的比例略高。

近几十年来，有关证的生物学基础研究开展的很多，虽然有一些现象被发现，但至今尚未有公认的结论。前期研究发现，肝癌肝肾阴虚证患者外周血单个核细胞中17个基因的mRNA表达与非肝肾阴虚证患者存在差异，为了体现中医“异病同证”思想，减轻疾病本身对证候标识基因的影响，同时选择了肝肾阴虚发病率较高的老年高血压患者进行观察，同样检测从肝癌患者中筛选出的这17个mRNA。与肝癌肝肾阴虚证相比，老年高血压肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证患者外周血单个核细胞的总RNA中仅发现MLH3和CD55这两个基因的mRNA表达在2组之间存在差异。而CD55在高血压肝肾阴虚证中的表达与肝癌中相反。可能原因：（1）原发性肝癌与原发性高血压属于两种不同的疾病，老年高血压更是存在特殊性，因此很多基因的表达可能与疾病的关系更为密切。（2）由于老年高血压入组患者年龄都大于65岁，普遍高于肝癌患者，可能会影响某些基因的表达。（3）样本量偏小，离散度偏大。

证候与疾病的发生、发展是密不可分的，证候学对人们预防疾病、治疗及预后康复的调整方面均有着一定的指导意义。然而，证候理论尚未有、形成完整的体系，有待完善。应当在继承、整理、总结前人经验的基础上，将证候理论与现代医学的新思路、新方法相结合，探索中医证候的分子基础，拓展中医证候理论。此研究是在假设“异病同证”存在相同的差异基因表达的前提下进行的探索性研究，筛选出的标识基因只能说是与老年高血压肝肾阴虚证密切相关，与其他疾病的肝肾阴虚证是否相关需要进一步验证。

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[3]周仲英.中医内科学 [M].北京：中国中医药出版社,2007: 303-420.

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[5]弓永莉,王利然,刘海红,等.老年高血压病中医证型调查分析[J].中医临床研究,2014,6(10):132-133.

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[11]卢灿辉,林汉平.卢永兵治疗老年高血压病经验 [J].中医药研究,1999,15(6):40.

Clinical Features of Elderly Hypertensive Patients w ith Deficiency Syndrome of Both Liver and Kidney Yin

Bai Lingling,Zhong Maofeng,Du Juan,Ling Changquan*
Department of TCM,Second M ilitary Medical University,Shanghai,200433,P.R.China

Objective To observe the clinical features and expression of marker genes in peripheral blood in elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver and kidney yin.Methods The correlation of hypertension grades and the course of the disease to deficiency syndrome of both liver and kidney yin was first studied;17 mRNA expressions w ith differentia were screened out from primary liver cancer patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin and from primary liver cancer patients w ith no deficiency syndrome of both liver and kidney yin by chromosomal microarray,and then the real-time fluorescence quantitative PCR technology was applied in observing if there existed the mRNA expressions same w ith the 17 in peripheral blood mononuclear cells of the elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin;the diagnostic model was set up based on the Receiver Operating Characteristic(ROC)curves.Results In total,the study enrolled 60 elderly hypertensive patients(＞65 years old),30 patients w ith deficiency syndrome of both liver and kidney yin while 30 patients w ith no;more elderly hypertensive patients got deficiency syndrome of both liver and kidney yin w ith the course of hypertension lasting;the MLH3 expression in peripheral blood mononuclear cells of the elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin decreased much more than that in patients w ith no deficiency syndrome of both liver an kidney yin while CD55 expression was enhanced,the difference was of statistical significance;ROC analysis showed that AUCMLH3=0.783 and AUCCD55=0.737;the sensitivity of MLH3 and CD55 of the diagnostic model was 63.5% and 57%respectively.Conclusions MLH3 and CD55 may be the marker genes in elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin.

elderly;deficiency syndrome of both liver an kidney yin;MLH3;CD55

2016-11-25）

（本文编辑：夏世金）

国家自然基金面上项目（81273881）

凌昌全，电子信箱:lingchangquan@hotmail.com

*Corresponding author:Ling Changquan,E-mail:lingchangquan@hotmail.com