辣椒（Capsicum annuum L.）热休克因子家族（CaHsfs）全基因组分析、表达谱分析及CaHsfA2的鉴定

Guo MengLu JinpingZhai YufeiChai WeiguoGong Zhenhui*Lu Minghui*

（1.西北农林科技大学园艺学院， 陕西榆林 712100；2. 杭州市农业科学研究院蔬菜研究所， 浙江杭州 310024 ）

E-mail：zhgong@nwsuaf.edu.cn；xnjacklu@nwsuaf.edu.cn

辣椒（Capsicum annuum L.）热休克因子家族（CaHsfs）全基因组分析、表达谱分析及CaHsfA2的鉴定

Guo Meng1Lu Jinping1Zhai Yufei1Chai Weiguo2Gong Zhenhui1*Lu Minghui1*

（1.西北农林科技大学园艺学院， 陕西榆林 712100；2. 杭州市农业科学研究院蔬菜研究所， 浙江杭州 310024 ）

E-mail：zhgong@nwsuaf.edu.cn；xnjacklu@nwsuaf.edu.cn

背景：热休克因子（Hsf）在植物生长和防御过程中具有重要作用。辣椒（Capsicum annuum L.）是重要的蔬菜作物，其产量和质量受高温、盐渍及渗透胁迫等环境胁迫影响而严重降低。尽管辣椒基因组测序已经完成，但Hsf家族在非生物胁迫条件下的作用尚不明确。结果：通过生物信息学分析及PCR检测，在辣椒基因组中共鉴定出25个CaHsf。根据Hsf的保守结构域，CaHsf可分为3类，分别是CaHsfA、CaHsfB和CaHsfC；除第11号染色体外，该家族基因在其他11条染色体上均有分布；除CaHsfA5外，该家族蛋白均能形成蛋白互作网络。据辣椒栽培种CM334的转录组数据，大部分CaHsf基因在根、茎、叶、果皮、胎座等组织中不止一处表达。qRT-PCR表明，除耐热株系R9叶片中的CaHsfC1外，所有CaHsf均响应高温胁迫（40℃，2 h）；且其表达模式与热敏株系B6的CaHsf表达模式不同。许多CaHsf也受到盐胁迫、渗透胁迫、外源Ca2+、腐胺、ABA和茉莉酮酸甲酯的调控。此外，CaHsfA2定位于细胞核，且具有转录活性，具有Hsf的典型特征。随时间变化，CaHsfA2响应高温胁迫的表达谱表明，CaHsfA2在辣椒热敏株系B6与耐热株系R9中的表达模式与表达水平均不相同。结论： 从辣椒基因组中鉴定了25个Hsf，多数响应高温胁迫、盐胁迫、渗透胁迫及外源物质，为进一步研究辣椒CaHsf在各非生物胁迫中的功能及相应的信号转导途径奠定了基础。

辣椒；CaHsf家族鉴定；非生物胁迫；CaHsfA2；基因表达

1 背景

植物作为固着生物，形成了多种防御机制以抵御持续变化的胁迫因子，如极端温度、盐渍与干旱[1]等。温度是影响作物生长发育的重要因子，高温会显著降低作物的产量和质量[2-4]。Hsp与虫咬伤害相关，且能使植物获得耐热性[5-6]；在高温胁迫（HS）下，植物细胞能诱导热激蛋白（Hsp）基因的表达以此对高温迅速做出反应。许多Hsp发挥分子伴侣的作用，以防止蛋白错误折叠与凝集，维持了细胞内蛋白的稳态，并使植物获得耐热性[7-9]。

热休克因子（Hsf）通过识别Hsp基因启动子区域内的热休克顺式作用元件（HSE）来调节Hsp基因的表达[1,10]。HSE的特征是含有多个GAA反向重复序列，且真核生物基因中至少有3个HSE模体，以此保证Hsf的结合效率[11-12]。在非胁迫条件下，Hsf保持非活性状态，并与Hsf90/Hsp70分子伴侣复合物形成细胞质复合物[8,13]。Hsf是细胞质蛋白，在高温胁迫下会从分子伴侣复合体脱离，经磷酸化、泛素化、三聚反应及核输入后与靶基因的HSE结合[1,13-14]。Hsf家族结构保守。除了序列和大小上具有较大差异外，Hsf家族的结构和功能在所有真核生物间都是保守的[8,15]。植物中Hsf的DNA结合结构域（DBD）高度保守，由N端1个反向平行的4链β折叠（β1、β2、β3和β4）和3螺旋束（α1、α2和α3）构成，以满足定位与识别HSE的要求[16-18]。寡聚合域（OD，或HR-A/B域）具有转录活性，与DBD通过由7个疏水氨基酸构成的柔性链接结合在一起[19-21]。此外，一些Hsf中存在其他特殊结构，如：核定位信号（NLS），由一簇碱性氨基酸组成，在核输入过程起重要作用；核输出信号（NES），富含亮氨酸；短肽模体（AHA模体），起催化作用；阻遏域，特征是C端4肽LFGV[1,22-24]。

不同真核生物的Hsf基因数量差异巨大。动物和酵母体内的Hsf基因数量较少，果蝇（Drosophila melanogaster）、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）只含有1个Hsf基因，脊椎动物有4个Hsf基因[25]。而植物恰恰相反，其体内含有大量Hsf家族基因。其中，拟南芥（Arabidopsis thaliana）有24个，水稻（Oryza sativa）有25个，玉米（Zea mays）有30个，大豆（Glycine max）有52个，番茄（Solanum lycopersicum）[1]至少有24个；这表明在不同物种的植物中， Hsf可能具多种功能，并以此避免胁迫伤害[1,26]。根据HR-A/B域的特性，植物Hsf被分为三族，分别为A族、B族和C族[20]。

A族和C族Hsf含有延长的HR-A/B域，在HR-A和HR-B域之间分别有21和7个氨基酸；而B族Hsf的HR-A和HR-B域之间非常紧凑，没有插入氨基酸[15,20]。此外，A族Hsf有AH激活结构域，该结构域含芳香族（W、F、Y）、疏水性（L、I、V）和酸性（D、E）氨基酸，而B族与C族Hsf没有[24]。B族Hsf除HsfB5外，在C端均含有RD，可能作为阻遏模体，使HsfB具有阻遏物的功能[27-30]。而拟南芥HsfB1能对耐热性获得进行正向调控[29]。这个矛盾有待进一步研究阐明。

许多植物的Hsf基因已经被分离出来并进行了深入研究。拟南芥HafA1与HsfA2形成二聚的超级激活体协同激活靶基因[31]。尽管HsfB1和HsfB2b对高温诱导Hsf的表达具有负调控作用，但两者对于植株耐热性获得是必不可少的[29]。番茄HsfA9在胚胎形成期和种子成熟期[32]上调表达；而HsfA5没有活性，且抑制HsfA4的活性[1]。HsfA2能提高植物在多种非生物胁迫下的耐性，如HS[1]、盐胁迫及渗透胁迫[33]、氧化胁迫[34]和缺氧胁迫[35]。番茄HsfA2能激活花药在高温胁迫下的保护机制，进而保证高温下的坐果[26,36]。

辣椒（Capsicum annuum L.）是一种重要的经济作物，对高温十分敏感，但目前对辣椒耐热分子机制的研究却并不充分[37-38]。目前仅有拟南芥、水稻、玉米、小麦和大白菜等少数几种模式植物中的Hsf基因家族被完全鉴定出来[8,20,39-41]。近年来，辣椒基因组测序结果的公布[42-43]为辣椒Hsf家族的鉴定奠定了基础，也为研究其响应各种胁迫的分子机制提供了资料。本研究利用生物信息学和表达分析对辣椒Hsf家族成员进行了全基因组分析。经生物信息学分析和PCR验证，共有25个Hsf家族成员被鉴定出来，本研究对其基因结构、保守结构域、染色体定位、基因重复和进化关系进行了分析。此外，我们也检测了Hsf在不同组织和不同胁迫条件下的表达水平。本研究为辣椒Hsf基因功能的研究奠定了基础，同时也为其他物种的Hsf基因功能的研究提供了参考。

2 方法

2.1 鉴定和注释甜辣椒（Capsicum annuum）Hsf家族成员

下载辣椒Hsf蛋白DBD保守结构域蛋白序列（Pfam：PF00047），与辣椒基因组数据库PGP中注释的蛋白序列进行BLAST比对（http://peppergenome.snu.ac.kr/，品种为CM334和Zunla-1），从植物转录因子数据库PTFD[44]下载拟南芥（Arabidopsis）、葡萄（Vitis vinifera）、毛果杨（Populus trichocarpa）全长Hsf蛋白序列与PGP和NCBI数据库的序列进行BLAST比对。采用默认参数（Limit Expect Value 1e-5）输出数据，使用Pfam （http://pfam.xfam.org/search）和SMART（http:// smart. embl-heidelberg.de/）对数据进行验证。使用DNAMAN软件（Lynnon Biosoft, QC, Canada）对CM334和Zunla-1的候选Hsf基因进行比对，挑出不属于这2个品种的序列。使用Primer Premier 5.0软件（Premier Biosoft International, CA, USA）设计引物（补充材料6，表S2），使用pI/MV软件（http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html）预测蛋白的分子质量和等电点。使用Heaster软件（http:// www. cibiv.at/services/hsf/）对辣椒Hsf蛋白进行分类。

2.2 系统进化分析

使用CLUSTALW软件对辣椒、番茄和拟南芥的Hsf蛋白N端序列（从DBD保守结构域到HR-A/B结构域）进行多序列比对，并使用MEGA 5.10软件[45]将该结果构建成系统进化树[1,41]。CLUSTALW软件参数设置如下：gap open penalty为10；gap extension penalty为0.2；protein weight matrix为Gonnet；residue-specific gap penalties为on；hydrophilic penalties为on；gap separation distance为0；end gap separation penalty为on；use negative matrix为on；delay divergent cutoff（%）为30。系统发育树参数为pairwise deletion，1000 bootstraps和a Poisson model。

2.3 辣椒Hsf蛋白序列分析和保守结构域鉴定

使 用Gene Structure Display Server（GSDS，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）[46]， 将cDNA与其对应的基因组DNA序列比对，区分Hsf基因的内含子和外显子并绘图。使用MEME（http:// meme-suite.org/tools/meme）鉴定保守结构域，参数如下：number of repetitions为any；maximum number of motifs为25；optimum motif widths为6 ～ 200 amino acid residues。使用Pfam（http://pfam.xfam. org/search）、SMART（http://smart.embl-heidelberg. de/）和Heatster在线工具对保守结构域进行注释。

2.4 染色体定位与基因重复

根据PGP数据库的信息，使用MapDraw[47]将基因比对到染色体上，并确定基因在染色体上的物理位置。使用植物基因重复数据库（Plant Genome Duplication Database，PGDD，http://chibba.agtec. uga.edu/duplication/index/locus）鉴定辣椒Hsf的基因重复。非同义（Ka）与同义（Ks）比值（Ka/Ks）由辣椒Hsf基因的重复情况计算而来，其中Ks值以每年6.1×10-9位点的突变速率换算成以百万年为单位的进化时间，进化时间（T）的计算公式为：T = Ks/ （2×6.1×10-9）×10-6百万年[43,48]。

2.5 蛋白互作网络的预测

由于没有辣椒互作组的相关研究作为参考，本研究采用拟南芥同源蛋白预测CaHsf蛋白的互作网络。首先用CaHsf序列在INPARANOID（http://inparanoid.sbc.su.se/cgi-bin/index.cgi）[49]中搜索拟南芥同源序列。使用AraNet（http://www. functionalnet.org/aranet）获得拟南芥同源蛋白（AtHsf）的边缘信息文件（edge information）[50]，随后将其绘制到CaHsf上以获得CaHsf成员的边缘信息文件。最后，使用Cytoscape_v3.2.1软件（National Institute of General Medical Sciences，美国）绘制CaHsf的蛋白互作网络图。

2.6 材料、培养条件及胁迫处理

本研究使用2个辣椒材料，分别为耐热辣椒R9（引种自亚洲蔬菜研究与发展中心）和热敏辣椒B6（由西北农林科技大学园艺学院辣椒研究小组选育）。辣椒幼苗在培养室中培养，温度26℃/20℃，光周期16 h / 8 h，培养至6 ～ 8片真叶后进行处理。HS处理是将6 ～ 8真叶期的R9、B6辣椒苗置于40℃的光照培养箱中（GXZ-380C，江南仪器厂，中国）。在HS处理的0 h和2 h取叶片[37-38]。HS处理下CaHsfA2表达水平分析（图8a）的取样时间分别为HS处理的0 h、0.5 h、1 h、4 h、6 h，恢复处理 （温度26℃/20℃，光周期16 h / 8 h）的2 h、4 h、24 h、48 h。对于其他处理，R9幼苗分别进行盐胁迫、渗透胁迫、ABA、茉莉酮酸甲酯（MeJA）、CaCl2和腐胺（Put）处理，具体处理为300 mM NaCl 6 h、5 %甘露醇6 h、100 μM ABA 3 h、100 μM MeJA 6 h、15 mM CaCl2 6 h和1.5 mM Put 6 h。MeJA使用10%乙醇溶解，其他试剂使用水溶解，MeJA处理的对照喷施10%乙醇，其余对照组喷水。NaCl和甘露醇处理取根和茎，其余处理取叶片，液氮速冻，于-80℃保存用于RNA提取。每个样品设置3个生物学重复。

2.7 RNA提取和实时荧光定量分析

使用Total RNA kit（BioTeke，中国）按照说明书的方法提取RNA，按说明书（Takara，中国）进行cDNA合成，并使用ddH2O稀释到50 ng/μL。用Primer Premier 5.0设计实时荧光定量反应（qRTPCR）所需的辣椒Hsf基因C端引物对（补充材料7：表S3），并使用NCBI Primer BLAST（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_ LOC=BlastHome）验证引物的合理性。以辣椒泛素结合蛋白基因UBI-3为内参基因[51]。反应体系20 μL：2 μL cDNA模板、上下游引物各0.8 μL（10 μM）、10 μL 2 ×SYBR Green Supermix（Takara，中国）及6.4 μL ddH2O。反应于iQ5.0 Bio-Rad iCycler thermocycler（Bio-Rad，美国）中进行。反应程序：95℃ 1 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。每个循环后采集荧光信号，将PCR产物从56℃加热到95℃，绘制溶解曲线，鉴定引物特性。qPCR设置3个生物学重复和3个技术性重复，使用-ΔΔCT法计算Hsf基因的相对表达量[52]。

2.8 辣椒Hsf基因组织特异性表达分析

根据辣椒各组织基因表达谱RNA-seq数据[42]，本研究选择了CM334 17个组织和发育阶段的数据，对CaHsf基因的组织特性表达和各发育时期的表达情况进行分析。组织有根、茎、叶，花后6、16、25 d的果皮和胎座（PC-6DPA、PC-16DPA、PC-25DPA，PL-6DPA、PL-16DPA、PL-25DPA），绿熟期的果皮和胎座（PC-MG、PL-MG），破色期的果皮和胎座（PC-B、PL-B），破色5 d、10 d的果皮和胎座（PC-B5、PC-B10，PL-B5、PL-B10）。使用Heml软件（The Cuckoo Workgroup，中国）制作22个Hsf基因数据（除缺失的CaHsfA1e、CaHsfB3b和CaHsfB4）的热图。

2.9 CaHsfA2的细胞定位

根据之前的研究[37]，以HS处理2 h的R9叶片cDNA为模板，设计引物（前引物5’-GCTCTAGAT CCATCTTAATTGTATTTAGCGAC-3’，后引物5’-C GGGGTACCAAGGAAACCAAGTT GATCTACA AG-3’）PCR获得CaHsfA2不含终止密码子的ORF。划线的碱基分别表示XbaI和KpnI酶切位点。将PCR获得的CaHsfA2片段与pBI221融合构建表达载体，以不含CaHsfA2的CaMV35S::GFP（pBI221）载体为对照。使用Bio-Rad He/1000 particle delivery system（Bio-Rad, Hercules，美国）分别将5 μg CaMV35S::CaHsfA2-GFP和5 μg CaMV35S::GFP转入洋葱（Allium cepa）表皮细胞中。将转化细胞置于1×MS固体培养基上，28℃培养24 h后，使用A1R激光共聚焦显微镜（Nikon，日本）观察绿色荧光蛋白。

2.10 CaHsfA2转录激活鉴定

转录激活鉴定使用酵母AH109菌株，该菌株含LacZ和His报告基因。设计引物（前引物5'-TCCATCTTAATTGTATTTAGCGAC-3'，后引物5'-AGGGAATGATAGAGTCGTGGG-3'）扩增全长CaHsfA2基因。将PCR产物重组到pMD19-T载体（Takara，中国），片段5’末端与Pmd19-T的SmaI位点连接，3’末端与PstI位点连接；测序正确后，使用限制内切酶SmaI和PstI进行酶切，将回收片段重组到pGBKT7载体上，构建pGBKT7-CaHsfA2重组载体。按照说明书（Clontech，美国）分别将pGBKT7-CaHsfA2和阴性对照pGBKT7转入酵母AH19中。重组菌株经PCR和测序鉴定后，在SD/ Trp-和SD/Trp-Ade-His-平板上培养。30℃培养3 d后，根据酵母在含X-α-gal培养基上的生长情况判断基因的转录活性。

2.11 数据获取

本研究的系统进化数据可从TreeBase（http:// purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S17530）下载，编号为17530。RNA-seq数据可从辣椒品种CM334基因组下载（http://www.nature.com/ ng/journal/v46/n3/full/ng.2877.html#supplementaryinformation）[42]。

3 结果

3.1 辣椒Hsf基因家族的鉴定

以Hsf DBD结构域（Pfam：PF00447，http:// pfam.sanger.ac.uk/）的隐马尔科夫模型（HMM）作为BLAST序列在辣椒基因组数据库PGP（http:// peppergenome.snu.ac.kr/）中比对搜索；同时PTFD（Plant Transcription Factor Data-base, http://plntfdb. bio.uni-potsdam.de/v3.0/）中的拟南芥、葡萄和毛果杨的Hsf蛋白也作为BLAST序列在PGP中比对搜索。最初从辣椒栽培品种CM334中共得到了26个Hsf候选基因，将其与栽培品种Zunla-1基因组对应的基因进行比对，将与之不同的序列再次放大并纠正对应的辣椒Hsf基因。经Pfam、SMART（http:// smart.embl-heidelberg.de/）和Heatster（http://www. cibiv.at/services/hsf/）分析发现，一个候选基因（基因ID：CA01g30350）缺乏完整的DBD结构域，因此将其从候选基因中排除。最终从辣椒中共鉴定出25个Hsf基因（表1），其分类和命名规则参照拟南芥和番茄的Hsf家族基因[1]。CaHsf家族的CDS序列小到606 bp （CaHsfB5），大到1 518 bp （CaHsfAlb），蛋白序列分别有201个和505个氨基酸，分子质量分别为23.37 kDa和56.06 kDa。CaHsf蛋白家族的等电点差异较大，25个成员的等电点从4.65到9.20不等，其中17个成员属于A族（CaHsfAs），7个属于B族（CaHsfBs），只有1个属于C族（CaHsfCs）。CaHsfA族中，CaHsfA9（4个成员，CaHsfA9a、 CaHsfAb、CaHsfAc和CaHsfAd）、CaHsfA1（3个成员， CaHsfA1b、CaHsfAd和CaHsfAe）、CaHsfA6 （3个成员， CaHsfA4a、CaHsfAb和CaHsfAc）较其他亚族更长。

表1 CaHsf家族成员

3.2 辣椒Hsf蛋白保守结构域的鉴定

采用MEME在线工具（http://meme-suite. org/tools/meme）分析鉴定辣椒CaHsf蛋白的保守模体结构（图1、表2）。辣椒25个Hsf家族成员中均含有模体1和模体3，CaHsfA5缺乏模体2，CaHsfC1缺乏模体5。一些模体只在特定的Hsf蛋白中存在，如模体4仅存在于CaHsfA族和CaHsfC族中，而CaHsfB族中没有。通常，CaHsfB族中的模体数量少于CaHsfA族。

为充分了解CaHsf家族的结构特征，本研究采用Heatster软件分析了CaHsfs的保守结构域（表3）。从3类CaHsf中鉴定出6个保守结构域，分别为DBD、HR-A/B、NLS、AHA、RD和 NES。DBD与模体1一致，与模体2、模体3部分一致（图1），是Hsfs中最为保守的序列，在25个CaHsf蛋白中均有发现（补充材料1：图S1）。

DBD由3个α螺旋（α1、α2和α3）和4个β折叠（β1、β2、β3和β4）构成，CaHsfA5中不含α1，且β1不完整，因此其序列较其他的CaHsf蛋白更短。除DBD外，HR-A/B是另外一个核心保守结构域，同样在所有CaHsf蛋白中存在，其他的4个保守结构域只存在于特定的CaHsf中。CaHsfA族中，17个蛋白均具有NLS结构域。CaHsfA9的NLS结构域最长（57 ～ 248个氨基酸），覆盖了DBD和HR-A/B结构域；而CaHsfA9b、CaHsfA9c和CaHsfA9d的NLS结构域最短，仅有2个氨基酸。AHA是CaHsfA族蛋白特有的结构域，在CaHsfA2中有3个，在CaHsfA3中有4个，但在CaHsfA9b中没有。对于CaHsfB族蛋白而言，CaHsfB1和CaHsfB5不含NLS结构域；而CaHsfB3a与CaHsfA9a相似，含有较长的NLS序列（从第10到第218个氨基酸）并覆盖了DBD和HR-A/B序列。LFGV是RD的核心结构，为4肽模体，除CaHsfB5外，在所有CaHsfB族蛋白中均存在，但只有CaHsfB4含NES结构域。有意思的是，在CaHsfC1中只有2个结构域BDD和HR-A/B。

图1 使用MEME软件鉴定的辣椒Hsf蛋白模体

3.3 辣椒Hsf蛋白的进化分析及序列结构分析

表2 使用MEME鉴定的模体序列

为研究Hsf家族的进化关系，取各物种Hsf的保守氨基酸序列（从DBD第1个氨基酸到HR-A/B最后1个氨基酸）绘制进化树[1,41]，其中辣椒的Hsf蛋白25个，拟南芥21个，番茄（S. lycopersicum）25个，玉米（Z. mais）21个，水稻（O. sativa）25个（图2）。Hsf蛋白构建的进化树显示，HsfA族的亚族最多，共有5个集群，其中有4个集群（A1和A8、A2和A6、A3和A7、A9）与HsfC族相似，1个集群（A4和A5）与HsfA相似。拟南芥2个HsfA7蛋白（AT3G51910.1和AT3G63350.1）没有与其他物种的HsfA7蛋白聚类到一起，而是与HsfA6蛋白相似。同样的情况也出现在玉米HsfA7亚族蛋白ZM2G005815、玉米HsfA8亚族蛋白ZM2G118485、水稻HsfB4亚族蛋白Os07g44690.1和辣椒CaHsfAc上，它们分别与HsfB2亚族、HsfA4亚族、HsfA2亚族和HsfA1亚族相似。与拟南芥相比，玉米、水稻和番茄的Hsf蛋白与辣椒的Hsf蛋白更为接近，这个结果与植物学分类结果相一致。

表3 辣椒中CaHsf蛋白的功能结构域

此外我们也绘制了辣椒Hsf蛋白保守结构域（从DBD域到HR-A/B域）的进化树（补充材料2：图S2A），其模体分布（图1，表2）和系统发育组（图2）的特征与前文提到的结果相一致。本研究通过编码序列和对应的基因组序列，分析了辣椒25个Hsf蛋白内含子和外显子的结构，以期进一步了解该家族基因的重复事件和进化模式。CaHsf家族的内含子和外显子在结构上高度保守，含一个内含子，内含子相位为0（补充材料2：图S2B）。其中，15个CaHsf蛋白的内含子位于DBD域内；4个蛋白的内含子位于NLS域和AHA域之间；CaHsfA4a和CaHsfA4b的内含子位于AHA1域和AHA2域之间。内含子长度在77 bp （CaHsfB2a） ～ 3 205 bp（CaHsfA5）之间。

图2 辣椒、番茄、拟南芥、水稻和玉米的Hsf蛋白构建系统发育树

3.4 染色体定位与辣椒基因组中Hsf基因的重复

本研究根据辣椒基因组数据库PGP中CaHsf的物理位置，确定了CaHsf的染色体分布。辣椒有12条染色体，其中在11条染色体上定位了Hsf基因，在11号染色体上没有Hsf基因（补充材料3：图S3）。每条染色体上，CaHsf基因的数量差异显著。2号染色体上的CaHsf基因数量最多，共5个；3号染色体上有4个CaHsf基因；9号染色体上有3个CaHsf基因；1号、4号、6号、7号和12号染色体上分别有2个CaHsf基因；5号、8号和10号染色体上只有1个CaHsf基因。

植物基因组重复数据库（PGDD，http:// chibba.agtec.uga.edu/duplication/）对植物基因重复数据库PGDD的分析表明，有两对辣椒Hsf蛋白CaHsfA4a/CaHsfA4c和CaHsfB3a/CaHsfB3b是部分重复序列（补充材料3：图S3；补充材料4：表S1），且每对基因的2个重复序列都在不同的染色体上（分别在2号、4号染色体，5号、10号染色体上）。2对重复序列的非同义替代（Ka）与同义替代（Ks）之比（Ka/Ks）小于1.0，表明纯化选择导致了序列的进化，且重复事件分别发生在4590万年前（CaHsfA4a/CaHsfA4c）和7131万年前（CaHsfB3a/ CaHsfB3b）[43,48]。

3.5 CaHsf家族的蛋白互作网络

本研究根据拟南芥同源互作组预测了CaHsf家族的互作网络，以期为CaHsf家族的研究提供更多的信息。除CaHsfA5外，所有的CaHsf蛋白均形成复杂的互作网络（补充材料5：图S4）。CaHsfA5的拟南芥同源蛋白AtHsfA5和At4g13980在拟南芥中也没有Hsf互作蛋白。CaHsFA族中，CaHsFA2、CaHsFA3、CaHsFA6（CaHsFA6a、CaHsFA6b、和CaHsFA6c）能和多数CaHsf蛋白互作，且CaHsfA1亚族3个蛋白（CaHsfA1b、CaHsfA1d和CaHsfA1e）彼此之间能产生互作。与CaHsfA亚族和其他CaHsfB亚族蛋白相比，CaHsfB亚族的CaHsfB1、CaHsfB3a和CaHsfB3b的互作网络更为简单，各有9个、6个和6个互作蛋白，且不会与CaHsfA2、CaHsfA1和CaHsfA6亚族蛋白互作。总的来说，CaHsfA亚族蛋白的互作蛋白多于CaHsfB亚族和CaHsfC亚族。

3.6 CaHsf基因在不同器官和不同发育时期的表达分析

为研究CaHsf基因在辣椒生长发育中的功能，本研究以辣椒CM334为材料，分别检测了CaHsf家族在5个不同组织的表达水平，以及CaHsf家族在果皮和胎座7个发育时期的表达水平，并根据RNA-seq数据绘制了热图（图3）。不同CaHsf基因在不同组织和发育阶段的表达水平具有显著差异。在CaHsfA亚族中，CaHsfA2、CaHsfA6a和CaHsfA9a的表达水平相对较高；而CaHsfA4c、CaHsfA6b、CaHsfA9b和CaHsfA9c在所有组织中的表达水平相对较低，甚至为0；其余的CaHsfA基因在某些组织中的表达水平较高。如CaHsfA4b在根部、PL-6DPA（花后6 d的胎座）和PL-16DPA（花后16 d的胎座）的表达量高于其他组织，但在PL-B10（花后10 d的胎座）中几乎没有表达。CaHsfA2、CaHsfA6a和CaHsfA9a在生殖器官的表达量相对较高，如PL-B（破色期胎座）中的CaHsfA2，PC-MG和PL-MG（绿熟期的果皮和胎座）中的CaHsfA6a，以及PC-B10（破色10 d的果皮）中CaHsfA9a。CaHsfB1在所有组织中的表达水平均较高，在PL（包括PL-16DPA、PL-25DPA、PL-MG和PL-B）的表达水平尤其高。相比之下，CaHsfB2b在PC-B（破色期的果皮）和PC-B5的表达量最低，在其他组织中几乎没有表达。较其他组织和PL其他发育时期，CaHsfB3a在PL-16DPA的表达量较高。纵观营养器官和生殖器官，CaHsfC1表达量最高处在叶片和PL-B5，表达量最低处在PL-B。

图3 辣椒Hsf基因组织特异性表达分析

3.7 HS处理下CaHsf基因的表达分析

图4 qRT-PCR分析HS处理下B6和R9叶片中CaHsf相关基因的表达水平

为研究CaHsf的热响应曲线，本试验以热敏株系B6和耐热株系R9为材料，分别检测了植株在HS条件（40℃，12 h）下叶片中CaHsf的转录水平[37-38]。如图4所示，高温胁迫下R9的叶片中有22个CaHsf基因上调表达（＞2倍），占总数的88%；2个CaHsf基因（CaHsfB3a和CaHsfB3b）下调表达（＜0.5倍）；而CaHsfC1的表达无显著变化。在上调表达的基因中，CaHsfA2、CaHsfA3、CaHsfA6c、CaHsfB1和CaHsfB5的表达水平显著高于其他基因，且表达量升高最多的是CaHsfA3（＞140倍），其次是CaHsfA2（＞20倍）。与其他亚族 相 比，CaHsfA1亚 族（CaHsfA1b、CaHsfA1d和CaHsfA1e）的表达并不显著。2对重复基因（CaHsfA4a、CaHsfA4c；CaHsfB3a、CaHsfB3b）在HS处理下表达水平没有显著差异。在热敏株系B6中，只有13个基因上调表达，占总数的52%；表达水平维持稳定的基因有10个，比株系R9多。HS处理下的B6株系中，CaHsfA1d、CaHsfA2和CaHsfA3的表达受显著诱导；热敏株系B6和耐热株系R9中的CaHsfA2和CaHsfA3基因对HS的响应都非常强烈（图4）。

3.8 CaHsf基因响应盐胁迫和渗透胁迫的表达谱

众所周知，Hsf与植物的耐热驯化相关，但其他不利因素如盐和渗透胁迫同样会影响植物的生长发育，CaHsf基因是否与这些逆境相关有待探究。因此我们设计试验，分别使用300 mM NaCl和5%甘露醇处理R9株系的根和茎6 h，并得到CaHsf基因的表达谱。

学院坚持创新创业教育工作“一把手”工程，成立由学院院长担任组长，分管教学、学工和科研的副院长担任副组长，蓝岛创客空间、教务处、学工处、科研及校企合作处、人事处、五系、继续教育学院相关负责人为成员的创新创业教育工作领导小组，形成齐抓共管的联动协调机制，确保“双创教育试点班”人才培养计划的落实。

盐处理下，根和茎中6个基因（CaHsfA1b、CaHsfA3、CaHsfA9a、CaHsfA9c和CaHsfC1） 上调表达，而CaHsfA2、CaHsfA6c和CaHsfB4下调表达（图5）。根和茎中5个基因（CaHsfA1d、CaHsfA4b、CaHsfA8、CaHsfB2b和CaHsfB3a）的表达水平未受到调控，其余11个基因在根或茎中的表达水平只是有所变化。此外， aHsfA1e、CaHsfA4c和CaHsfB1在根中受诱导上调表达，而在茎中不受诱导；CaHsfA4a、CaHsfA5、CaHsfA6b和CaHsfB1只在茎中大量表达。有意思的是，CaHsfA9中CaHsfA9d在根中的表达水平显著升高（＞30倍），而CaHsfA9a在茎中的表达受到显著诱导（约40倍）。

渗透胁迫下，9个基因（CaHsfA1b、CaHsfA1d、CaHsfA4a、CaHsfA6a、CaHsfA9a、CaHsfA9d、CaHsfB3a、CaHsfB3b和CaHsfB5）上调表达，其 中4个（CaHsfA4c、CaHsfA8、CaHsfA9b和CaHsfB4）在根和茎中均上调表达，根中表达量最高的是CaHsfA9（＞160倍），茎中表达量最高的是CaHsfB3b（约46倍）。根和茎中没有基因下调表达。值得注意的是，根和茎中的CaHsfA1b、CaHsfA9a和CaHsfA9d都能受盐胁迫和渗透胁迫的诱导，尤其是CaHsfA9d。

3.9 外源ABA、MeJA、腐胺（Put）和CaCl2处理下CaHsf基因的表达谱

植物激素和信号分子如ABA、MeJA、Put和Ca2+参与多种胁迫信号途径[6,38,53]。为研究CaHsf家族基因是否响应这些信号物质，本研究以R9植株叶片为材料，分析了在这些外源物质处理下CaHsf家族基因的表达谱。如图5所示，CaCl2处理后13个CaHsf基因显著地上调表达，而12个基因下调表达。Put处理后，11个CaHsf基因上调表达，没有基因下调表达。25个CaHsf基因中，受ABA诱导上调表达的基因有5个，下调表达的基因有7个；受MeJA诱导上调表达的基因有4个，下调表达的基因有9个。

图5 qRT-PCR分析多种非生物胁迫下R9植株中CaHsf基因转录水平

CaHsfB1可以受4种信号物质的诱导上调表达；而CaHsfA9a和CaHsfA9b受CaCl2、Put和ABA的诱导上调表达，受MeJA的诱导下调表达。此外，CaHsfA6a受CaCl2和Put的诱导上调表达，受ABA和MeJA的诱导下调表达。受CaCl2、Put和MeJA诱导上调表达最多的分别是CaHsfA9d、CaHsfA9a和CaHsfA1d；但是经ABA处理后，CaHsf的转录水平不如其他3个处理高。经ABA处理后，CaHsfB1最高的表达水平较对照升高不足5倍。

3.10 CaHsfA2定位于细胞核

由于CaHsfA2在耐热细胞[1]中具有重要作用，且其表达水平显著上调（图4），因此进一步研究辣椒的CaHsfA2。为验证CaHsfA2是否定位于细胞核，本研究采用瞬时表达体系，构建35S::CaHsfA2-GFP（pBI221-CaHsfA2-GFP）融合表达载体，使用基因枪法转化洋葱表皮细胞。使用空载35S::GFP（pBI221-GFP）转化的洋葱表皮细胞在细胞核、细胞质及细胞膜上均有绿色荧光表达情况。而使用融合蛋白表达载体35S::CaHsfA2-GFP转化的洋葱表皮细胞仅在细胞核有荧光信号，表明CaHsfA2定位于细胞核中（图6）。3.11 CaHsfA2具有转录活性

图6 CaHsfA2-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞的瞬时表达

3.12 CaHsfA2在2个耐热性不同的辣椒株系中对HS的响应具有差异

为进一步研究CaHsfA2对HS的响应，本研究分析了在HS条件下和室温恢复阶段该基因分别在热敏株系B6和耐热株系R9中的表达情况（图8a）。40℃处理0.5 h后，B6和R9的CaHsfA2均上调表达（图8b，样品b）；而在HS处理最后阶段，即40℃处理6 h时，R9叶片中CaHsfA2的表达水平与对照相比处于高位，约为40倍（图8b，样品a）。幼苗经热处理后，将其移至室温恢复处理48 h，恢复初期（2 h至4 h）R9中的CaHsfA2表达水平维持高位，而在恢复一段时间后（24 h至48 h）R9和B6的CaHsfA2表达水平均降低（图8b，样品h和样品i）。值得注意的是，R9经HS处理4 h后，CaHsfA2的表达水平（样品d）低于HS处理1 h后的表达水平（样品c），且B6 CaHsfA2的表达水平在HS处理的最后阶段有轻微下降（样品c）。

图7 CaHsfA2蛋白在酵母中的反式作用活性

图8 HS处理下辣椒CaHsfA2的表达水平

4 讨论

越来越多的证据表明，Hsf在植物生长和防御过程中具有重要作用[5,12,14,31-32,36,54]。得益于基因组学的进步，多种植物的Hsf家族基因得到了鉴定，包括模式植物拟南芥[20,55]、玉米[8]、水稻[39]，以及其他作物如龙须菜[56]、大白菜[40]和苹果[57]。然而，由于目前对耐热的分子机制了解甚微，因此辣椒Hsf的功能尚不明确。

本研究根据辣椒基因组，从营养价值和经济价值较为重要的辣椒中鉴定出了25个Hsf基因[42,58]（表1）。虽然辣椒的Hsf基因的数量与拟南芥、番茄相似[1]，但辣椒一些特殊Hsf亚族与以上两个物种有较大差异。例如与番茄相比，辣椒的HsfA1亚族成员较少，HsfA6亚族成员较多，没有HsfA7亚族，表明辣椒在进化过程中发生了基因丢失[39]。另一个有趣的发现是，辣椒的CaHsfA9亚族发生了扩张，有4个基因，而番茄该亚族只有1个基因。通常真双子叶植物中只有1个HsfA9基因，如拟南芥和番茄，而大豆中有2个，巨尾桉（桃金娘科）至少含有17个与HsfA9编码基因密切相关的基因[1]。CaHsfA9基因数量增加的原因有待进一步研究。

Hsf蛋白的DBD结构域长度约由100个氨基酸组成，在酵母、哺乳动物和植物中高度保守[18]；而辣椒CaHsfA5的DBD结构域仅72个氨基酸，比其他CaHsf蛋白的DBD短，原因是缺少1个完整的α1螺旋和1个截短的β1折叠。但CaHsfA5 DBD中的核心元件α2-turn-α3和截短β1折叠中的色氨酸是完整的，α2-turn-α3的功能是与HSE产生互作，色氨酸主要构成芳香族互作[59]，这使得CaHsfA5蛋白具有基本的功能，但其不完整的DBD需要进一步的鉴定。AHA是HsfA亚族[1]中重要的结构域，具有激活功能，而有趣的是CaHsfA9b和CaHsfA9d中均不含该结构域（表3）。缺失AHA结构域的Hsf蛋白能利用色氨酸残基来改变激活子的功能，或与其他Hsf蛋白形成异源二聚体来行使功能[39,60]。

系统进化分析表明，与拟南芥、玉米、水稻和番茄相比，辣椒Hsf蛋白与番茄的Hsf蛋白同源性更高（图2），这与植物学分类的结果相一致[42]。辣椒HsfA9亚族中的4个蛋白（CaHsfA9a、CaHsfA9b、CaHsfA9c和CaHsfA9d） 与3个 番 茄 蛋 白（Sl07g040680、Sl02g072060和Sl11g008410） 聚类在了HsfA9亚族。番茄HsfA9亚族中，只有1个蛋白属于Hsf9A亚族，其他2个蛋白Sl02g072060和 Sl11g008410属于类Hsf蛋白（Hsf ），分别为Hsf 1和Hsf 2[1]。单子叶植物的基因重复导致了HsfC2的产生，该蛋白成为了单子叶植物特有的蛋白[1,41]，双子叶植物不含HsfC2蛋白，这是单子叶植物与双子叶植物间最显著的不同。单子叶植物中没有HsfA9、HsfB3和HsfB5，这些蛋白可能产生在单、双子叶植物的分化之后[1]（图2）。结构分析表明，所有的CaHsf基因都只有1个内含子（补充材料2，图S2B），这表明其进化是保守的；而各基因插入内含子长度不同，这可能影响CaHsf基因功能的分化。

辣椒共有12条染色体，除11号染色体外，其余11条染色体上均有CaHsf基因分布。番茄的1号和5号染色体同样缺失Hsf基因，表明Hsf基因在茄科植物共同祖先的基因组上广泛分布。基因重复是帮助植物适应各种环境胁迫的主要进化机制[43]。水稻、玉米和苹果有多对旁系同源Hsf基因，各有9对[39]、9对[8]和12对[57]；而辣椒中较少，仅有2对，分别为CaHsfA4a/CaHsfA4c和CaHsfB3a/ CaHsfB3b。4个基因分布于不同的染色体。旁系同源基因起源于染色体间的部分重复，CaHsfA4a/ CaHsfA4c和CaHsfB3a/CaHsfB3b的产生分别发生在4590万年前和7131万年前。由于多数多倍体植物的基因组中含有大量重复的染色体片段，因此部分重复发生的几率明显大于串联重复和易位[43,61]。部分重复在进化缓慢的基因家族中频繁发生[61]，且在家族进化中具有重要作用，据此推测辣椒Hsf家族基因进化的速度与玉米Hsf家族基因进化的速度一样缓慢[8]。

植物的生命活动是由于蛋白间的互作。蛋白互作网络的结构能够为生命活动机制的解析和未知蛋白生物功能的研究提供重要参考。本研究根据拟南芥同源蛋白，构建了CaHsf蛋白的互作网络（补充材料5，图S4）。在3个CaHsf族中，CaHsfA的互作蛋白最多，表明CaHsfA作为主要调节因子可能具有特殊功能，是植物在极端HS条件下生存必不可少的蛋白[1,26]。在复杂的互作网络中，拟南芥的CaHsfA1（CaHsfA1b、CaHsfA1d和CaHsfA1e）与CaHsfA2互作，这些蛋白协同形成超级激活复合体，显著调节下游的HS相关基因的表达[31]。与拟南芥同源的CaHsfA5（AtHsfA5）虽然没有参与复杂的互作网络，却与抗凋亡因子AtHsfA4互作并抑制其活性[62]，表现出促凋亡的作用。在辣椒中CaHsfA5可能具有相似的功能，但结果有待进一步研究。

基因的表达模式与其功能密切相关[39]。我们研究了CaHsf基因在5个不同组织中的表达谱。正常条件下，CaHsfA2、CaHsfA6a、CaHsfA9a和CaHsfB1在不同组织不同发育阶段的表达水平相对较高（图3）。其他植物中具有类似的现象，如拟南芥的AtHsfA1型基因[63]，苹果的MdHsfA1a、MdHsfA1d、MdHsfB1a和MdHsfB1b基因[57]，小麦的HsfA1、HsfA8亚族基因，以及部分HsfA2、HsfA6亚族基因[41]。不同组织和生育期的表达谱显示大量辣椒CaHsf家族成员存在组织表达特异性和时期表达特异性，如根部的CaHsfA1b，PL-16DPA的CaHsfB3a，PC-B10的CaHsfB5，及叶片和PL-B5的CaHsfC1；这表明CaHsf基因家族广泛地参与了植物的生长发育，这对于研究CaHsf基因在辣椒发育生物学中的功能具有重要作用[64]。

HS条件下，多数CaHsf基因上调表达。CaHsfAd、CaHsfA2、CaHsfA3、CaHsfA6c和CaHsfB5是B6和R9中在HS条件下表达水平显著升高的基因，表明这些CaHsf蛋白是Hsp基因的主要转录因子[41]（图4）。番茄是辣椒的近亲，其体内的HsfA1a是引发高温响应和获得高温耐性的主效调控因子，且无法被其他Hsf蛋白代替[26]。耐热株系R9的CaHsfA族中，CaHsfA1亚族的3个基因（CaHsfA1b、CaHsfA1d和CaHsfA1e）与CaHsfA2、CaHsfA3和CaHsfA6c相比表达并不显著；与之类似的是，在拟南芥的4个HsfA1基因中也没有主效调控因子[1]。该结果表明，在调控植物HS反应时，Hsf蛋白的作用具有种间差异。HS条件下，株系R9中上调表达的CaHsfA基因有17个，株系B6中只有10个，CaHsfA2、CaHsfA3、CaHsfA6c、CaHsfB1和CaHsfB5在R9中的表达量高于B6，而CaHsfA1d在B6中的表达量高于R9。这些表达量同时升高的CaHsfA基因可能共同作用于下游的HS相关基因，进而提高辣椒的耐热性。

HS条件下，株系R9叶片7个CaHsfB族基因中有5个显著上调，尤其是CaHsfB1和CaHsfB5，结果与小麦中的HsfB1和HsfB2一致[41]。除HsfB5外，多数HsfB蛋白C端含有LFGV四肽，该结构是转录结构的阻遏物[8]。番茄的相关研究能够解释多数CaHsfB在HS条件下的表达模式。该研究表明HsfB1能够与其他蛋白互作发挥调控作用，如与HsfA1a或HsfA2互作，调节不同阶段的HS响应；或者与HsfA1a和组蛋白乙酰基转移酶HAC1形成三聚体[1]，促进报告基因的激活[65]。不过，这些在HS条件下上调表达的CaHsfB基因具有何种功能仍需要进一步的研究。HS条件下，B6和R9叶片的CaHsfB3a和CaHsfB3b均下调表达，表明旁系同源基因可能会抑制CaHsf基因的表达。S条件下，R9的CaHsfC1表达水平没有显著变化，与玉米HsfC族[8]的ZmHsf-13的表达模式类似；而B6的CaHsfC1下调表达，其表达模式与小麦的HsfC1亚族相似[41]。产生这种现象的原因可能是由于HsfC族对HS的响应存在种间差异和品种差异，但有待进一步研究。

除HS外，CaHsf基因同样受到盐胁迫和渗透胁迫的调控（图5）。CaHsfA1b、CaHsfA9a和CaHsfA9d能受HS、盐胁迫和渗透胁迫的诱导，而CaHsfA6c和CaHsfB4的表达受盐胁迫的抑制，在HS条件下增强。CaHsfB3a和CaHsfB3b在渗透胁迫下上调表达，而在HS下下调表达，该现象表明这对旁系同源基因在面对其他胁迫时具有特殊功能，以此增加植物对胁迫的适应性[41]。有趣的是，CaHsfA2在盐胁迫和HS下的表达模式不同，甚至在渗透胁迫下的根和茎中也具有不同的表达模式；AtHsfA2超表达显示该基因不仅与耐热性相关，也与耐盐性和耐渗透胁迫相关[33]，表明CaHsf基因在不同胁迫下不同组织中具有不同功能，一些CaHsf基因可能参与多种胁迫响应[64]。

Ca2+、Put、ABA和MeJA在各种胁迫下参与多种信号转导途径，并调控CaHsf基因的表达。不同信号调控不同的CaHsf基因。例如，Ca2+和Put能够使CaHsfA6a、CaHsfA9a和CaHsfA9d上调表达，而ABA和MeJA使CaHsfA6a下调表达，表明虽然多数CaHsf蛋白高度保守，但在不同的信号转导途径中具有不同功能。Ca2+作为第二信使，联合胞内外信号和生化反应调节植物细胞在胁迫下的信号转导。在HS下，拟南芥需要以钙调素AtCaM3作为信号激活钙调素结合蛋白激酶（CBK）使HsfA1a磷酸化[6]。因此可以推断，辣椒经Ca2+处理后，CaM3通过钙调素信号途径诱导CaHsfA6a、CaHsfA9a和CaHsfA9d上调表达。非生物胁迫下，Put通过调节细胞pH值控制活性氧的合成，维持细胞膜结构的稳定性，但目前没有Put调控Hsf基因的报道[66]。我们之前的研究表明Put与HS过程相关，本研究中，Put诱导CaHsfA2、CaHsfA3、CaHsfA6a、CaHsfA9a、CaHsfA9d和CaHsfB4上调表达，这就能够解释之前的现象了[38]。许多研究报道ABA[67-69]和MeJA[70-71]在高温伤害中具有保护作用。CaHsfA6a受ABA诱导上调表达，受Ca2+和Put影响下调表达，表明CaHsfA6a在ABA、Put和Ca2+介导的生理过程中具有不同作用。虽然CaHsfA1b、CaHsfA4a和 CaHsfA4b的启动子区域含有响应MeJA的顺式作用元件，CGTCA-或TGACG-模体，但MeJA却不能影响这些基因的表达水平，这可能是由其他顺式作用元件和复杂调控机制共同作用造成的。

HsfA2受HS诱导，能增强植物的耐热性[1]，多种植物中均有研究[5,23,31]；而目前对辣椒HsfA2的研究却非常有限[37]。本研究发现CaHsfA2在Hsf家族中具有典型的特征，如CaHsf蛋白因NLS结构域定位于细胞核（图6，表3），具有转录活性（图7），且对持续的HS产生响应（图8）；这些结果应证本研究对CaHsf的全基因组鉴定是正确的。25个辣椒Hsf基因中，HS处理下CaHsfA2的表达量仅次于R9的CaHsfA3和B6的CaHsfA1d，表明CaHsfA2可能如拟南芥和番茄中的HsfA2那样，是Hsf家族的优势基因[72]（图4）。HS条件下，热敏辣椒B6 CaHsfA2的表达水平低于耐热辣椒R9，这可能是两种辣椒具有不同耐热能力的原因（图8）。可是，HS处理4 h后R9中CaHsfA2水平低于1 h的水平，且B6的CaHsfA2在HS处理后期显著下调表达。可能是调控基因或生物钟导致了不同的表达模式。长时间HS处理下，Hsp17-II维持在较高水平，且直接和HsfA2产生互作，形成无活性的复合物[1]。一旦缺少分子伴侣，HsfA2就会从复合物中脱离，并行使转录因子的功能。此外，HS处理后HsfB2b受诱导上调表达，但受HsfA2的抑制。虽然CaHsfA2响应CaHsfA2的调控机制有待进一步研究，但CaHsfA2很可能像拟南芥HsfB2b一样，是节律基因，受HS和生物钟的共同调控[73]。

5 结论

本研究从辣椒基因组中共鉴定出25个CaHsf基因。根据保守结构域和生物信息学分析，CaHsf基因被分为3族，分别为CaHsfA、CaHsfB和CaHsfC，12条染色体中有11条分布了CaHsf基因，11号染色体上没有CaHsf基因。根据CM334的RNA-seq数据，CaHsf基因在根、茎、叶、果皮和胎座中均有表达。实时荧光定量表明，除耐热辣椒R9叶片的CaHsfC1外，其他CaHsf能够响应HS（40℃ 12 h），而热敏辣椒B6的响应模式有所不同。许多CaHsf基因能够被盐胁迫和渗透胁迫的诱导，也能被一些信号物质诱导，如Ca2+、Put、ABA和MeJA。此外，CaHsfA2具有Hsf蛋白的典型特征，定位于细胞核，具有转录活性，并能够响应长时间的HS。本研究为植物Hsf家族添加了一名新成员，并为今后研究CaHsf在各种非生物胁迫下的功能和辣椒信号转导途径提供了资料。

6 缩略词

Hsf：热休克因子；qRT-PCR：实时荧光定量PCR；HS：高温胁迫；Hsp：热休克蛋白；HSE：热休克元件；DBD：DNA结合结构域；OD：寡聚结构域；AA：氨基酸；NLS：核定位信号；NES：核输出信号；RD：阻遏域；HMM：因马尔科夫模型；CBK：钙调素结合蛋白激酶；PGDD：植物基因组重复数据库；GFP：绿色荧光蛋白；PTFD：植物转录因子数据库；Put：腐胺；ABA：脱落酸；MeJA：茉莉酮酸甲酯。

[1] Scharf K D, Berberich T, Ebersberger I, Nover L. The plant heat stress transcription factor (Hsf) family: structure, function and evolution[J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1819(2): 104-119

[2] Wardlaw I F, Wrigley C W. Heat tolerance in temperate cereals: an overview[J]. Australian Journal of Plant Physiology, 1994, 21(6): 695-703

[3] Skylas D J, Cordwell S J, Hains P G, Larsen M R, Basseal D J, Walsh B J, et al. Heat shock of wheat during grain f lling: proteins associated with heat-tolerance[J]. Journal of Cereal Science, 2002, 35(2): 175-188

[4] Bar A T, Rudich J, Bravdo B. High temperature effects on CO2gas exchange in heat-tolerant and sensitive tomatoes[J]. J Am Soc Hort Sci., 1985: 110, 582-586

[5] Charng Y Y, Liu H C, Liu N Y, Chi W T, Wang C N, Chang S H, et al. A heat-inducible transcription factor, HsfA2, is required for extension of acquired thermotolerance in Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2007, 143(1): 251-262

[6] Mittler R, Finka A, Goloubinoff P. How do plants feel the heat?[J]. Trends in Biochemical Sciences, 2012, 37(3): 118-125.

[7] Sung D Y, Kaplan F, Lee K J, Guy C L. Acquired tolerance to temperature extremes[J]. Trends in Plant Science, 2003, 8(4): 179-187

[8] Lin Y X, Jiang H Y, Chu Z X, Tang X L, Zhu S W, Cheng B J. Genome-wide identification, classification and analysis of heat shock transcription factor family in maize[J]. BMC Genomics, 2011, 12: 76

[9] Parsell D A, Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins.[J]. Annual review of genetics, 1993, 27: 437-496

[10] Bienz M, Pelham H R B. Mechanisms of heat-shock gene activation in higher eukaryotes [J]. Advances in genetics, 1987, 24: 31-72

[11] Xiao H, Perisic O, Lis J T. Cooperative binding of Drosophila heat shock factor to arrays of a conserved 5 bp unit [J]. Cell, 1991, 64(3): 585-593

[12] Kumar M, Busch W, Birke H, Kemmerling B, Nürnberger T, Schöff F, et al. Heat shock factors HsfB1 and HsfB2b are involved in the regulation of Pdf1.2 expression and pathogen resistance in Arabidopsis[J]. Molecular Plant, 2009, 2(1): 152-165

[13] Hahn A, Bublak D, Schleiff E, Scharf K D. Crosstalk between Hsp90 and Hsp70 chaperones and heat stress transcription factors in tomato[J]. Plant Cell, 2011, 23(2): 741-755

[14] Pérez-Salamó I, Papdi C, Rigó G, Zsigmond L, Vilela B, Lumbreras V, et al. The heat shock factor A4A confers salt tolerance and is regulated by oxidative stress and the mitogen-activated protein kinases MPK3 and MPK6[J]. Plant Physiology, 2014, 165(1): 319-334

[15] Baniwal S K, Bharti K, Chan K Y, Fauth M, Ganguli A, Kotak S, et al. Heat stress response in plants: a complex game with chaperones and more than twenty heat stress transcription factors[J]. Journal of Biosciences, 2004, 29(4): 471-487

[16] Harrison C J, Bohm A A, Nelson H C. Crystal structure of the DNA binding domain of the heat shock transcription factor[J]. Science (New York, N.Y.), 1994, 263(5144): 224-227

[17] Vuister G W, Kim S J, Wu C, Bax A. NMR evidencefor similarities between the DNA-binding regions of Drosophila melanogaster heat shock factor and the helixturn-helix and HNF-3/forkhead families of transcription factors [J]. Biochemistry, 1994, 33(1): 10-16

[18] Schultheiss J, Kunert O, Gase U, Scharf K D, Nover L, Rüterjans H. Solution structure of the DNA-binding domain of the tomato heat-stress transcription factor HSF 24[J]. Eur J Biochem, 1996, 236(3): 911-921

[19] Peteranderl R, Rabenstein M, Shin Y K, Liu C W, Wemmer D E, King D S, et al. Biochemical and biophysical characterization of the trimerization domain from the heat shock transcription factor.[J]. Biochemistry, 1999, 38(12): 3559-3569

[20] Nover L, Bharti K, Döring P, Mishra S K, Ganguli A, Scharf K D. Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: How many heat stress transcription factors do we need?[J]. Cell Stress and Chaperones, 2001, 6(3): 177-189

[21] Nover L, Scharf K D, Gagliardi D, Vergne P, Czarnecka-Verner E, Gurley W B. The Hsf world: classif cation and properties of plant heat stress transcription factors.[J]. Cell stress & chaperones, 1996, 1(4): 215-223

[22] Lyck R, Harmening U, Höhfeld I, Treuter E, Scharf K D, Nover L. Intracellular distribution and identification of the nuclear localization signals of two plant heat-stress transcription factors[J]. Planta, 1997, 202(1): 117-125

[23] Heerklotz D, Döring P, Bonzelius F, Winkelhaus S, Nover L. The balance of nuclear import and export determines the intracellular distribution and function of tomato heat stress transcription factor HsfA2[J]. Molecular and Cellular Biology, 2001, 21(5): 1759-1768

[24] Kotak S, Port M, Ganguli A, Bicker F, von Koskull-Döring P. Characterization of C-terminal domains of Arabidopsis heat stress transcription factors (Hsfs) and identification of a new signature combination of plant class A Hsfs with AHA and NES motifs essential for activator function and intracellular localization[J]. Plant Journal, 2004, 39(1): 98-112

[25] Akerfelt M, Morimoto R I, Sistonen L. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2010, 11(8): 545-555

[26] Mishra S K, Tripp J, Winkelhaus S, Tschiersch B, Theres K, Nover L, et al. In the complex family of heat stress transcription factors, HSfA1 has a unique role as master regulator of thermotolerance in tomato[J]. Genes & Development, 2002, 16(12): 1555-1567

[27] Czarnecka-Verner E, Pan S Q, Salem T, Gurley W B. Plant class BHSFs inhibit transcription and exhibit affinity for TFIIB and TBP[J]. Plant Molecular Biology, 2004, 56(1): 57-75

[28] Ikeda M, Ohme-Takagi M. A novel group of transcriptional repressors in Arabidopsis[J]. Plant and Cell Physiology, 2009, 50(5): 970-975

[29] Ikeda M, Mitsuda N, Ohme-Takagi M. Arabidopsis HsfB1 and HsfB2b act as repressors of the expression of heat-inducible Hsfs but positively regulate the acquired thermotolerance[J]. Plant Physiology, 2011, 157(3): 1243-1254

[30] Zhu X, Thalor S K, Takahashi Y, Berberich T, Kusano T. An inhibitory effect of the sequence-conserved upstream open-reading frame on the translation of the main openreading frame of HsfB1 transcripts in Arabidopsis[J]. Plant Cell and Environment, 2012, 35(11): 2014-2030

[31] Chan-Schaminet K Y, Baniwal S K, Bublak D, Nover L, Scharf K D. Specific interaction between tomato HsfA1 and HsfA2 creates hetero-oligomeric superactivator complexes for synergistic activation of heat stress gene expression[J]. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(31): 20848-20857

[32] Kotak S, Vierling E, Bäumlein H, von Koskull-Döring P. A novel transcriptional cascade regulating expression of heat stress proteins during seed development of Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2007, 19(1): 182-195

[33] Ogawa D, Yamaguchi K, Nishiuchi T. High-level overexpression of the Arabidopsis HsfA2 gene confers not only increased themotolerance but also salt/osmotic stress tolerance and enhanced callus growth[J]. Journal of Experimental Botany, 2007, 58(12): 3373-3383

[34] Zhang L, Li Y, Xing D, Gao C. Characterization of mitochondrial dynamics and subcellular localization of ROS reveal that HsfA2 alleviates oxidative damage caused by heat stress in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany, 2009, 60(7): 2073-2091

[35] Banti V, Mafessoni F, Loreti E, Alpi A, Perata P. The heatinducible transcription factor HsfA2 enhances anoxia tolerance in Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2010, 152(3): 1471-1483

[36] Giorno F, Wolters-Arts M, Grillo S, Scharf K D, Vriezen W H, Mariani C. Developmental and heat stress-regulated expression of HsfA2 and small heat shock proteins in tomato anthers[J]. Journal of Experimental Botany, 2010, 61(2): 453-462

[37] Guo M, Yin Y X, Ji J J, Ma B P, Lu M H, Gong Z H. Cloning and expression analysis of heat-shock transcription factor gene CaHsfA2 from pepper (Capsicum annuum L.) [J]. Genetics and Molecular Research, 2014, 13(1): 1865-1875

[38] Guo M, Zhai Y, Lu J, Chai L, Chai W G, Gong Z H, et al. Characterization of CaHsp70-1, a pepper heat-shock protein gene in response to heat stress and some regulation exogenous substances in Capsicum annuum L.[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2014, 15(11): 19741-19759

[39] Guo J, Wu J, Ji Q, Wang C, Luo L, Yuan Y, et al. Genomewide analysis of heat shock transcription factor families in rice and Arabidopsis[J]. Journal of Genetics and Genomics, 2008, 35(2): 105-118

[40] Song X, Liu G, Duan W, Liu T, Huang Z, Ren J, et al. Genome-wide identif cation, classif cation and expression analysis of the heat shock transcription factor family in Chinese cabbage[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2014, 289(4): 541-551

[41] Xue G, Sadat S, Drenth J, McIntyre C L. The heat shock factor family from Triticum aestivum in response to heat and other major abiotic stresses and their role in regulation of heat shock protein genes[J]. Journal of Experimental Botany, 2014, 65(2): 539-557

[42] Kim S, Park M, Yeom S I, Kim Y M, Lee J M, Lee H A, et al. Genome sequence of the hot pepper provides insights into the evolution of pungency in Capsicum species[J]. Nature Genetics, 2014, 46(3): 270-278

[43] Chen X, Chen Z, Zhao H, Zhao Y, Cheng B, Xiang Y. Genome-Wide analysis of soybean HD-Zip gene family and expression profiling under salinity and drought treatments[J]. Plos One, 2014, 9(e871562)

[44] Perez-Rodriguez P, Riano-Pachon D M, Correa L G, Rensing S A, Kersten B, Mueller-Roeber B. PInTFDB: updated content and new features of the plant transcription factor database[J]. Nucleic Acids Research, 2010, 381: D822-D827

[45] Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731-2739

[46] Guo A Y, Zhu Q H, Chen X, Luo J C. GSDS: a gene structure display server[J]. Yichuan, 2007, 29(8): 1023-1026

[47] Liu R H, Meng J L. MapDraw: a microsoft excel macro for drawing genetic linkage maps based on given genetic linkage data.[J]. Hereditas (Beijing), 2003, 25(3): 317-321 [48] Lynch M, Conery J S. The evolutionary fate and consequences of duplicate genes[J]. Science (Washington D C), 2000, 290(5494): 1151-1155

[49] Remm M, Storm C E V, Sonnhammer E L L. Automatic clustering of orthologs and in-paralogs from pairwise species comparisons[J]. Journal of Molecular Biology, 2001, 314(5): 1041-1052

[50] Lee I, Ambaru B, Thakkar P, Marcotte E M, Rhee S Y. Rational association of genes with traits using a genomescale gene network for Arabidopsis thaliana[J]. Nature Biotechnology, 2010, 28(2): 149-156

[51] Wan H, Yuan W, Ruan M, Ye Q, Wang R, Li Z, et al. Identif cation of reference genes for reverse transcription quantitative real-time PCR normalization in pepper (Capsicum annuum L.)[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2011, 416(1-2): 24-30

[52] Schmittgen T D, Livak K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CTmethod[J]. Nature Protocols, 2008, 3(6): 1101-1108

[53] Fujita M, Fujita Y, Noutoshi Y, Takahashi F, Narusaka Y, Yamaguchi-Shinozaki K, et al. Crosstalk between abiotic and biotic stress responses: a current view from the points of convergence in the stress signaling networks[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2006, 9(4): 436-442

[54] Bechtold U, Albihlal W S, Lawson T, Fryer M J, Sparrow P A, Richard F, et al. Arabidopsis heat shock transcription factora1b overexpression enhances water productivity, resistance to drought, and infection[J]. Journal of ExperimentaL Botany, 2013, 64(11): 3467-3481

[55] Swindell W R, Huebner M, Weber A P. Transcriptional profiling of Arabidopsis heat shock proteins and transcription factors reveals extensive overlap between heat and non-heat stress response pathways[J]. BMC Genomics, 2007, 8: 125

[56] Yang Z, Wang Y, Gao Y, Zhou Y, Zhang E, Hu Y, et al. Adaptive evolution and divergent expression of heat stress transcription factors in grasses[J]. BMC Evolutionary Biology, 2014, 14: 147

[57] Giorno F, Guerriero G, Baric S, Mariani C. Heat shock transcriptional factors in Malus domestica: identif cation, classif cation and expression analysis[J]. BMC Genomics, 2012, 13: 639

[58] Qin C, Yu C, Shen Y, Fang X, Chen L, Min J, et al. Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(14): 5135-5140

[59] Sakurai H, Enoki Y. Novel aspects of heat shock factors: DNA recognition, chromatin modulation and gene expression[J]. FEBS Journal, 2010, 277(20): 4140-4149

[60] Bharti K, Schmidt E, Lyck R, Heerklotz D, Bublak D, Scharf K D. Isolation and characterization of HsfA3, a new heat stress transcription factor of Lycopersicon peruvianum[J]. Plant Journal, 2000, 22(4): 355-365

[61] Cannon S B, Mitra A, Baumgarten A, Young N D, May G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana[J]. BMC Plant Biology, 2004, 4: 10

[62] Baniwal S K, Chan K Y, Scharf K D, Nover L. Role of heat stress transcription factor HsfA5 as specific repressor of HsfA4[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(6): 3605-3613

[63] Busch W, Wunderlich M, Schoffl F. Identification of novel heat shock factor-dependent genes and biochemical pathways in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal, 2005, 41(1): 1-14

[64] Liu J, Chen N, Chen F, Cai B, Dal Santo S, Tornielli G B, et al. Genome-wide analysis and expression prof le of the bZIP transcription factor gene family in grapevine (Vitis vinifera)[J]. BMC Genomics. 2014, 15: 281

[65] Bharti K, von Koskull-Doring P, Bharti S, Kumar P, Tintschl-Körbitzer A, Treuter E, et al. Tomato heat stress transcription factor HsfB1 represents a novel type of general transcription coactivator with a histone-like motif interacting with the plant CREB binding protein ortholog HAC1[J]. Plant Cell, 2004, 16(6): 1521-1535

[66] Kang G, Wang Z, Sun G C. Physiological mechanism of some exogenous materials on increasing cold-resistance capability of plants[J]. Plant Physiology Communications, 2002, 38: 193-197

[67] Baron K N, Schroeder D F, Stasolla C. Transcriptional response of abscisic acid (ABA) metabolism and transport to cold and heat stress applied at the reproductive stage of development in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Science, 2012, 188: 48-59

[68] Larkindale J, Huang B. Thermotolerance and antioxidant systems in Agrostis stolonifera: involvement of salicylic acid, abscisic acid, calcium, hydrogen peroxide, and ethylene[J]. Journal of Plant Physiology, 2004, 161(4): 405-413

[69] Larkindale J, Knight M R. Protection against heat stressinduced oxidative damage in Arabidopsis involves calcium, abscisic acid, ethylene, and salicylic acid[J]. Plant Physiology, 2002, 128(2): 682-695

[70] Clarke S M, Cristescu S M, Miersch O, Harren F J, Wasternack C, Mur L A. Jasmonates act with salicylic acid to confer basal thermotolerance in Arabidopsis thaliana[J]. New Phytologist, 2009, 182(1): 175-187

[71] Dang F F, Wang Y N, Yu L, Eulgem T, Lai Y, Liu Z Q, et al. CaWRKY40, a WRKY protein of pepper, plays an important role in the regulation of tolerance to heat stress and resistance to Ralstonia solanacearum infection[J]. Plant Cell and Environment, 2013, 36(4): 757-774

[72] von Koskull-Doering P, Scharf K D, Nover L. The diversity of plant heat stress transcription factors[J]. Trends in Plant Science, 2007, 12(10): 452-457

[73] Kolmos E, Chow B Y, Pruneda-Paz J L, Kay S A. HsfB2bmediated repression of PRR7 directs abiotic stress responses of the circadian clock[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(45): 16172-16177

文献来源：BMC Plant Biology （2015），15：151（华中农业大学园艺林学学院 刘 越 孔秋生 译）