六味地黄丸对脑瘫模型大鼠脑组织单胺类神经递质影响的实验研究

高长玉，姜志梅，李博文，李冀*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江省小儿脑性瘫痪防治疗育中心博士后科研工作站，黑龙江 佳木斯 154003)

六味地黄丸对脑瘫模型大鼠脑组织单胺类神经递质影响的实验研究

高长玉1，2，姜志梅2，李博文1，李冀1*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江省小儿脑性瘫痪防治疗育中心博士后科研工作站，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：观察六味地黄丸对脑瘫模型大鼠脑组织单胺类神经递质的影响，探讨其治疗脑瘫的作用机理。方法：采用孕鼠腹腔注射脂多糖(LPS)合并缺氧方法制作脑瘫动物模型，通过对模型大鼠脑组织单胺类神经递质含量的检测，观察六味地黄丸的影响。结果：六味地黄丸能明显提高脑瘫模型大鼠脑组织中NE、DA、5-HT的含量，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：六味地黄丸能够改善脑瘫模型大鼠运动功能、感知觉障碍，其机理可能与调节脑组织单胺类神经递质水平有关。

六味地黄丸;脑瘫模型大鼠；单胺类神经递质

脑性瘫瘫(cerebral palsy，CP)简称脑瘫，是由于各种原因引起的婴儿出生前后1个月内颅脑损伤或发育缺陷所导致的姿势异常或者运动障碍，属于非进行性的脑损伤[1]。目前，脑瘫是儿童致残的主要疾病之一，国内外治疗方法多以康复训练为主，配合中医针灸、按摩、药物，以及高压氧、手术治疗等。本研究通过观察六味地黄丸对脑瘫模型大鼠脑组织单胺类神经递质的影响，以期为中医药防治小儿脑瘫提供实验依据和新思路。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级成熟Wistar大鼠雌性24只，雄性12只，体质量200～220 g，均购于哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(黑)2013-001。

1.1.2 药品与试剂

六味地黄丸(浓缩丸,北京同仁堂有限责任公司，批号15012157)；脂多糖(LPS,血清型055:B5，美国SIGMA公司);酶联免疫试剂盒(武汉博士德公司);8%氧气92%氮气混合气体(哈尔滨盛大气体公司)。

1.1.3 实验仪器

SpectraMax M2核酸酶标仪(美国Molecular Devices公司)；BX51荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)；MIKRO22台式离心机(德国赫提驰公司)；自制缺氧箱。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法

将雌雄大鼠置于明暗周期为12 h/12 h，温度(21±1)℃环境中常规饲养，自由进食饮水。适应环境1周后，于下午17时将大鼠按照雌雄比例2∶1合笼，第2天早晨7时观察雌鼠阴栓情况，并且进行阴道涂片的检查，如果雌鼠阴道涂片查得精子或发现阴栓，则标记为妊娠0 d，将怀孕雌鼠单独饲养。随机选取孕鼠15只分为造模组10只和对照组5只。造模组孕鼠在妊娠第16 d给予腹腔注射LPS(450 μg/kg)，注射12 h后将其置于缺氧环境(8%O2和92%N2混合气体)中2 h，6 h后再重复做一次。对照组孕鼠腹腔注射同等剂量生理盐水[2-3]。待孕鼠自然分娩后，将生产的幼鼠同笼饲养。

1.2.2 动物模型的筛选

以9日龄正常大鼠为标准，对其进行神经行为学测试，检测的内容包括动作姿势、肌张力、异常外观、异常动作和斜坡试验等。测试完成后，将大鼠各项神经行为学检测评分结果作正态检验，以单侧95%作为正常区间参考值范围筛选模型大鼠[4]。大鼠神经行为学检测具体内容和各项评分标准如下。

动作姿势：采用改良的Tarlov分级评定法，根据大鼠的动作程度分为4分：大鼠完全瘫痪，不能做任何运动，记为0分；大鼠严重瘫痪，支撑不起身体，可以做原地小幅度活动，不能爬行，记为1分；大鼠不能支撑起身体，但是可以做短距离爬行移动，记为2分；大鼠可以支撑起身体进行自主活动，但是爬行不稳，有跛行或者转圈翻滚现象，记为3分；大鼠可以有力地支撑身体，行走自如，没有动作行为障碍，记为4分。

肌张力：采用改良的Ashworth分级评定方法，根据大鼠肢体的活动范围和关节屈伸的自由程度分为5分。大鼠活动灵活自如，无肌张力增强，活动僵硬等现象，记为0分；大鼠有轻度的肌张力增高，在肢体屈伸过程中出现一些停顿，动作稍有滞涩，记为1分；大鼠肢体尚易屈伸，有轻度共济失调，有明显的肌张力增强，记为2分；大鼠活动困难，肢体屈伸动作僵硬，记为3分；大鼠有明显的共济失调表现，肢体屈伸活动明显受限，记为4分。

斜坡试验：将大鼠头向下倒置放于倾斜45°的木板上，开始记录大鼠身体扭转使头部向上，并转至与头部原始方向夹角>135°时所需要的时间，以秒为单位。

斜板试验出现异常的评定标准：大鼠转头所需要的时间>正常组。

异常动作与异常外观：异常动作有1)震颤；2)抽搐；3)痉挛扭动；4)动作反应缓慢；5)无力吮乳。外观异常有1)毛发稀疏；2)肢体残缺。

异常标准：上述情况出现一项即记为1分，结果≥1分即为异常。

经过对66只9日龄正常大鼠神经行为学测试，得出脑瘫模型大鼠筛选标准见表1。

表1 脑瘫模型大鼠筛选标准表(n=66)

根据表1标准对造模组大鼠进行神经行为学测试，筛选出模型大鼠。

1.2.3 实验分组

选取模型大鼠30只随机分为三组：中药治疗组、康复训练组、模型对照组，每组10只。另外再随机选取10只正常等龄大鼠作为空白对照组。

1.2.4 治疗方法

给药方法:中药治疗组模型大鼠按体质量灌服六味地黄丸混悬液，给药剂量根据临床常用量，按照人与大鼠体表面积进行折算。连续灌胃给药20天。模型对照组和空白对照组连续灌服20天等剂量生理盐水。

康复训练方法：通过在笼内释放风油精、白醋等有刺激性的气味；放置各种颜色、不同形状的物体，各种可以活动的“玩具”如跑轮、滑梯、小球、管道、台阶等进行丰富环境的刺激与运动训练[5]。每日对大鼠进行康复训练2次，每次30 min。同时多次抓取抚摸刺激大鼠，连续刺激训练20天。空白对照组和模型对照组大鼠分别饲养于无特殊刺激的标准环境之中，不做任何干预。

1.2.5 取材

用10%水合氯醛麻醉后快速断头处死大鼠，在冰盘上操作，取出脑组织，剥离脑膜及粗大血管，以冰生理盐水冲洗，称重。

1.2.6 组织匀浆

称重后立即置于9倍体积预冷生理盐水中，使用组织捣碎匀浆器在低温环境中将组织打碎，震荡制作匀浆。在低温离心机中离心、取上清液，置于-80℃冰箱待测。

1.3 观察指标

使用酶联免疫试剂盒，检测所取材的各组大鼠脑组织中去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的含量。

1.4 统计学处理

2 结果

各组大鼠脑组织单胺类神经递质的含量检测结果见表2～4。

表2 脑组织DA含量检测结果

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；与康复组比较，●P<0.05。

由表2可见，模型对照组与空白对照组比较，大鼠脑组织中DA含量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，康复训练组和中药治疗组大鼠脑组织中DA含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与康复训练组比较，中药治疗组大鼠脑组织中DA含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 脑组织5-HT含量检测结果

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；与康复组比较，●P<0.05。

由表3可见，模型对照组与空白对照组比较，大鼠脑组织中5-HT含量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，中药治疗组大鼠脑组织中5-HT含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与康复训练组比较，中药治疗组大鼠脑组织中5-HT含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表4 脑组织NE含量检测结果

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；与康复组比较，●P<0.05。

由表4可见，模型对照组与空白对照组比较，大鼠脑组织中NE含量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，康复训练组和中药治疗组大鼠脑组织中NE含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与康复训练组比较，中药治疗组大鼠脑组织中NE含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

小儿脑瘫的直接病因是在脑发育成熟之前，由脑损伤和/或发育缺陷所导致。临床表现以运动障碍和姿势异常为主，同时伴有认知、感觉、知觉、交流以及行为障碍[6]。脑损伤和脑发育缺陷发生的时间可以划分为三个阶段：出生前、围生期、出生后。近来认为发生于出生前的脑瘫占70%～80%，其中原因不明的占相当大的比例[7]。中医学虽无脑瘫之病名，但是古代医家对此已有深刻认识，将其归为“五迟”“五软”“五硬”等范畴[8-11]。认为其发病多因先天禀赋不足、精髓不允，肾气亏虚所致，治疗当补肾填精益髓以强壮筋骨为核心法则，方药以六味地黄丸为代表。

单胺类神经递质是中枢神经系统的重要递质，其主要功能为参与调解肌紧张、躯体运动、学习与记忆、情绪、精神活动以及内分泌活动等[12]。本研究结果表明，模型对照组大鼠脑组织中NE、DA、5-HT的含量明显降低，灌服六味地黄丸后，含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明六味地黄丸可通过调解单胺类神经递质水平来改善脑瘫模型大鼠运动功能、感知觉障碍等症状，这可能是六味地黄丸治疗脑瘫的作用机制之一。

[1] 李静,樊祥伟,高晶,等.电针刺激头部运动区对脑瘫鼠大脑磁共振弥散张量纤维束成像的影响[J].中医药信息,2015,32(6):63-65.

[2] 李晓捷,高晶,孙忠人.宫内感染致早产鼠脑瘫动物模型制备及其鉴定的实验研究[J].中国康复医学杂志,2004,19(12):885-889．

[3] 高峰,杨小鹏,陈刚,等.应用孕鼠腹腔注射脂多糖合并缺氧方法制作脑瘫动物模型的实验研究[J].临床和实验医学杂志,2011,10(7):489-491.

[4] 李珩.儿童脑性瘫痪的中医康复评定及相关证候的分子生物学机制研究[D].北京:北京中医药大学,2009:94-95.

[5] 蓝靖文.儿童脑性瘫痪临床中医证候学调查及相关中药干预研究[D].北京:北京中医药大学,2009:49.

[6] 胡红梅,安爱景,杜洪荣.穴位注射甲钴胺结合引导式教育降低痉挛型脑瘫患儿肌张力的临床研究[J].中医药信息,2016,33(5):76-78.

[7] 吴云.小儿脑性瘫痪的发病机制及诊治进展[J].安徽医学,2011, 32(6):859-862.

[8] 于雪峰,吕岫华,刘伟,等.应用功能核磁共振成像技术分析针刺加康复运动疗法促进脑瘫大脑再塑的作用机制[J].中医药信息,2014,31(1):70-75.

[9] 李静,樊祥伟,高晶,等.电针刺激头部运动区对脑瘫鼠大脑磁共振弥散张量纤维束成像的影响[J].中医药信息,2015,32(6):63-65.

[10] 王有鹏,李志军,关洋洋,等.舒筋健脑颗粒对痉挛性脑瘫大鼠模型作用机制的探索[J].中医药信息,2011,28(4):53-54．

[11] 六味地黄丸改善脑瘫模型大鼠运动功能的实验研究[J].中医药学报，2017,45(2)：80 -82.

[12] 施雪筠.生理学[M].北京:中国中医药出版社,2008:251.

黑龙江省博士后资助项目(No.LBH-Z13190)；黑龙江省研究生创新科研基金项目(2015)

高长玉(1971-)，男，教授，方剂学博士，硕士研究生导师，现为黑龙江省小儿脑性瘫痪防治疗育中心博士后科研工作站在站工作人员，主要从事方剂学的教学与科研工作。

李冀*(1960-)，男，教授，博士研究生导师，主要研究方向：方剂配伍规律及药效物质基础研究。

2016-10-20

R285.5

A

1002-2406(2017)03-0055-03

修回日期：2016-11-15