可注射间充质干细胞膜片修复兔颅骨极限缺损的实验研究

张 蓉，高 瞻，倪前伟，王荣耀

•基础研究•

可注射间充质干细胞膜片修复兔颅骨极限缺损的实验研究

张 蓉，高 瞻，倪前伟，王荣耀

（新疆军区总医院颌面外科 新疆 乌鲁木齐 830000）

目的：评价使用可注射骨髓间充质干细胞（marrow stromal cells，MSCs）膜片修复兔颅骨极限缺损的成骨能力。方法：将体外分离培养扩增的兔MSCs，使用成骨诱导培养液连续培养2周, 形成细胞膜片。采用16只大白兔构建兔颅骨极限缺损模型，随机分为两组，每组8只。实验组，颅骨缺损处注射MSCs膜片；对照组，颅骨缺损处不植入任何材料，分别于术后8周和l2周取材，通过大体观察、X线摄片及组织学检查分析其修复颅骨缺损的效果。结果：体外构建的MSCs膜片为细胞-细胞外基质聚合体，茜素红染色见膜片中细胞外基质内有钙化结节沉积，扫描电镜可见膜片内丰富的胶原纤维和矿化结节聚集。细胞膜片植入兔颅骨缺损，8周时形成组织工程骨，12周时缺损得到完全的骨修复，而对照组仅见纤维组织形成。结论：成骨性MSCs膜片具有良好的骨修复能力。

骨组织工程；间充质干细胞；细胞膜片技术；颅骨极限缺损

由于创伤、炎症和肿瘤等因素所致的骨缺损是引发肢体功能丧失的主要原因。尽管自体骨移植是治疗局部骨缺损的金标准，但是该方法由于取骨部位和数量的限制难以应用于较大的骨缺损。异体和异种骨移植，愈合过程漫长且存在不同程度的免疫排斥反应。随着组织工程学的崛起和不断发展，有望为骨修复与重建开辟新的途径。但研究发现，传统的“细胞－支架材料”策略，存在一些缺陷，如接种细胞大量流失、接种效率有限；细胞主要黏附于材料的表面而呈“渔网样”分布不均；常用的蛋白酶消化收集细胞，易改变细胞的表型和生化成分，也常常破坏细胞外基质和细胞间连接蛋白[1]。此外，现有的支架材料也不能完全满足构建组织的需要，存在潜在的免疫源性、生物活性不足，还可能由于不完全降解而形成纤维组织等问题[2-3]。

近年来出现的细胞膜片技术，提供了一种新的组织再生方法。它采用物理方法收获完整的膜片状形式的细胞-细胞外基质聚集体，转运或是粘附于材料表面，成为一个良好的骨构建单位。利用此技术已成功构建出骨、心肌、角膜、食管上皮等组织[4-6]。本实验，旨在探讨单纯MSCs膜片的正位成骨能力，实验将细胞膜片直接注射入兔颅骨极限缺损内，术后8周和l2周取材，通过大体观察、X线及组织学检查分析其骨修复效果。

1 材料和方法

1.1 实验动物：3月龄清洁级新西兰大白兔16只，体重2.5～3.0kg，由第四军医大学口腔医院实验动物中心提供，雌雄不限。随机分为两组，实验组和对照组，每组8只。

1.2 主要试剂和仪器：DMEM/F12培养基(Gibco，美国)，0.25%胰蛋白酶(Sigma，美国)，PBS(Sigma，美国)，胎牛血清(杭州四季青生物公司，中国)，地塞米松(Sigma，美国)，β-甘油磷酸钠(Sigma，美国)，L-抗坏血酸(Sigma，美国)；超净工作台（海尔公司，中国），CO2细胞培养箱（BINDER公司，德国），S-3400N扫描电镜 (Hitachi,日本)，倒置相差显微镜及照相系统(Olympas,日本)。

1.3 MSCs分离培养和细胞膜片的体外构建：据文献报道[7]的实验方法分离培养兔MSCs。将第2代MSCs按密度1×106/cm2接种至直径10cm的培养皿，使用成骨诱导培养液(含10%胎牛血清、地塞米松10nM、β-甘油磷酸钠10mM、抗坏血酸50mg/L的DMEM/F12培养液)，置于37℃、5%CO2培养箱连续培养，隔日半量换液1次。2周后皿底形成半透明乳白色薄膜，可使用组织镊将膜片提起，用眼科组织剪切碎成小片段，悬浮至0.5ml无血清的DMEM/F12培养液中备用。

1.4 膜片中细胞DNA含量测定：采用荧光比色分析测定DNA含量以代表膜片中的细胞总数。取细胞膜片以PBS液冲洗两次，加入10mM的乙二胺四乙酸2ml，超声裂解10min，再加入1M的磷酸二氢钾溶液0.3ml中。然后取上清液或小牛胸腺DNA标准液加入100ng/ml的Hoechst 33258荧光染料1.5ml和10mM的Tris缓冲液。使用DyNA Quant 200 荧光比色分析仪检测样品吸光度，再绘制荧光值与DNA含量标准曲线，最后计算样品的DNA含量。根据接种前单细胞悬液DNA含量与计数板计算所知细胞数量的比值关系，得出每个细胞的DNA含量(7.2pg DNA/cell)，从而计算出膜片的细胞总数。

1.5 MSCs膜片性能检测：定量检测ALP活性，PBS漂洗后加入0.2%TritonX-100裂解液，离心后取上清液与磷酸硝基苯基磷酸盐在37℃条件下反应30min，以酶联检测仪测定光吸收值以定量检测ALP活性。此外取部分膜片样本以4%多聚甲醛固定行茜素红染色，部分样本以3%戊二醛固定，行扫描电镜观察其超微形貌。

1.6 兔颅骨极限缺损模型的建立：16只新西兰兔以速眠新（0.2ml/kg）肌肉麻醉，用8%硫化钠头顶部脱毛、固定、消毒和铺巾；于头顶部向后做舌形切口，切开皮肤、皮下至骨膜，翻起组织瓣显露额骨和顶骨，制备直径为15mm的颅骨全层缺损区（图1A）；生理盐水冲洗，对位缝合创口；术后动物分笼饲养，每日给予庆大霉素8万单位肌注，连续3d，预防感染。

1.7 体内移植：术后第4天，实验组将MSCs膜片片段通过18G 针头注射入颅骨缺损处（图1B）；对照组颅骨缺损处不植入任何材料。

1.8 检测方法

1.8.1 大体观察：分别于术后8周及12周取材，每个时间点各取4只动物，大体观察缺损处成骨情况。

图1 颅骨缺损模型

1.8.2 X线摄片：观察骨缺损区阻射情况，拍片条件为电压50V，电流100MA，曝光时间0.05s。

1.8.3 组织学分析：样本经4%多聚甲醛固定，10% EDTA脱钙、脱水、石蜡包埋，切片行H&E染色光镜下行组织形态学定性分析。每组每例样本选取3张H&E切片，每张切片低倍镜下随机选择3个视野，由两人分别独立采用Leicas Qwin Pro-image图像分析系统(Wetzlar, 德国)观察，分析新生骨组织的面积百分比(新生骨面积/切片组织染色区横断面积)。

2 结果

2.1 MSCs膜片特性检测结果：MSCs高密度接种体外连续培养2周，形成半透明乳白色膜片，可用眼科镊将其完整夹持起来（图2A）；显微镜下观察膜片中细胞呈多层生长（图2B），茜素红染色见细胞外基质中沉积有多个大小不等的红色钙结节（图2C）；SEM下观察到膜片中纺锤样细胞（图3A），同时可见丰富的基质纤维和矿化结节聚集（图3B）；ALP定量检测结果显示，膜片片段的ALP含量略高于相同数目的单细胞。

图2 细胞膜片特性

图3 膜片SEM分析结果

2.2 MSCs膜片DNA含量检测结果：DNA含量在细胞接种后的第1～2天变化不明显；第3天开始迅速增加，至第12～14天趋于稳定，MSCs膜片中细胞DNA含量随着培养时间延长而逐渐增加，见表1。

表1 细胞DNA含量检测结果 (x¯±s)

2.3 标本大体观察结果：两组动物均成活。术后8周，实验组骨缺损区有部分硬组织形成，厚度不均，边界清楚，与周边骨质可见部分融合，但钳夹新生骨硬度明显低于周边骨质(图4A)；术后12周，实验组骨缺损区充填硬组织明显增多，植入物边缘与周边骨质有明显的骨融合，钳夹硬度亦增加,与周边骨质相近（图4B）。对照组在术后8周及12周，骨缺损区均为软组织充填，与周边颅骨界限清楚（图4C）。

图4 标本大体观察

2.4 X线摄片检测结果：术后8周，实验组骨缺损区内可见块状阻射影像，密度不均匀，且低于周围骨质，邻近骨床有明显环形透光影(图5A)；术后12周，实验组骨缺损区阻射影像面积增加，基本占据全部缺损区，与周边颅骨密度接近(图5B)；而对照组在术后8周及12周，骨缺损区均显示为明显的透光区，基本没有阻射影像(图5C)。

图5 X线摄片观察结果

2.5 组织学分析结果：标本HE染色及改良丽春红三色染色观察：术后8周实验组骨缺损区内有大量的组织工程骨形成，可观察到成行密集排列在骨小梁周围的成骨细胞，包埋于骨基质内的骨细胞，以及大量肥大透明软骨细胞（图6A、7A）；术后12周，缺损区内软骨组织进一步骨化，交织成网状的成熟骨小梁，并可见散在的滋养血管，形成骨髓腔结构（图6B、7B）。组织定量学分析：术后8周新生骨所占面积为31.7%；术后12周新生骨面积为58.6%。空白对照组8周和12周均仅见纤维组织，未见明显新骨形成(图6C～D、7C～D)。

3 讨论

图6 组织学HE染色检查结果

本研究证实了单纯利用骨髓间充质细胞膜片修复自体颅骨缺损的可行性，以骨髓间充质成骨细胞膜片技术构建的组织工程骨有望成为骨缺损修复的途径之一。与传统的组织工程骨修复骨缺损方法相比，具有以下优点：①采用全新的组织工程骨构建方法，未运用外源性支架材料，避免了其伴随的一些问题；②所构建膜片完全来源于自体干细胞，不会引起宿主的排斥。

细胞膜片技术最早由日本学者Okano等[8]发明，利用细胞对温敏性聚合物的亲和性获得细胞－细胞外基质聚集体，无需使用蛋白酶消化。2007年Zhou等[9]报道了更简便的细胞膜片制取方法，无需特殊材料或设备，细胞膜片形成后用细胞刮刀沿培养皿底刮取即可获得。目前细胞膜片技术在骨组织构建中也有诸多应用，但大多需要与支架材料相结合。Zhou等[9]将细胞膜片与磷酸三钙和聚已酸内酯复合材料复合，构建出组织工程骨。Ueha等[10]利用磷酸三钙作为支架材料，分别与骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞膜片复合培养，并用于兔股骨缺损治疗，结果表明磷酸三钙/骨髓间充质干细胞膜片复合物成骨能力更强，并能完全修复股骨缺损。Ma等[11]将成骨分化的MSCs膜片折叠成圆柱状，静置孵育后移植至裸鼠背部皮下，构建出具有一定体积和特定形态的组织工程骨。研究结果虽然证实了细胞膜片的异位成骨能力，说明单纯使用成骨性干细胞膜片也可构建出组织工程骨，但不能代表构建组织具有修复骨缺损能力。

骨极限缺损，指在特定的骨骼上所造成的不能自行修复并愈合的最小缺损，颅骨极限缺损模型已被广泛应用于骨组织再生检测试验中。根据国内外文献报道可知应用细胞膜片修复骨缺损的实验，大多采用复合支架材料的方式。黄辉等[12]报道将细胞膜片包裹圆形珊瑚支架，用于修复兔颅骨极限缺损，以自体骨和单纯珊瑚植入作为对照，结果显示细胞膜片/珊瑚组在16周时得到明显骨修复。闫旭等[13]报道将MSCs膜片结合冻存自体骨瓣回植于原颅骨缺损部位，对照组单纯植入冻存自体骨瓣，结果表明MSCs膜片能有效促进冻存自体骨瓣与骨缺损边缘的愈合。尽管已有众多材料被应用于构建组织工程骨，但仍未发现一种理想的材料。因而我们试图不使用外源性支架材料，从而避免可能引起的炎症反应、潜在的免疫原性、不完全降解而形成纤维组织等问题。

本研究中，MSCs连续培养后呈多层生长，不断分泌丰富的细胞外基质，细胞间连接为完整的膜片状结构，不必借助特殊的材料或设备，可通过简捷的操作收获。膜片中细胞完全包埋于基质内，体外培养的细胞几乎全部用于组织构建，细胞利用率高；采用物理方法收集体外扩增的多层生长的细胞，保留了自分泌的细胞外基质、细胞间连接和细胞表面蛋白等；组织学及扫描电镜检查结果显示，膜片由细胞及细胞外基质组成，基质中沉积丰富的矿化结节,具备成骨特性；X线片证实，细胞膜片植入体内12周后形成组织工程骨修复骨缺损，密度与周边正常颅骨接近；组织学检查发现，新生组织中有骨和软骨两种组织形成，表明膜片在体内成骨的过程中，既有膜内成骨，又有软骨内成骨。这一结果与采用细胞膜片与支架材料复合构建组织工程骨的报道相一致[14-15]。

本研究还存在一些不足，由于实验的目的在于验证单纯利用骨髓基质细胞膜片修复自体骨缺损的可行性，其修复效果未与自体骨移植相比较。此外，细胞膜片机械性能略差，如修复负重部位的骨缺损还需与固定装置联合应用。

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编辑/张惠娟

Repair of Critical Bone Defects with Injectable Mesenchymal Stem Cells Sheets

ZHANG Rong,GAO Zhan,NI Qian-wei,WANG Rong-yao (Department of Oral and Maxillofacial Surgery,General Hospital of Xinjiang Military Command,Urumqi 830000,Xinjiang,China)

Objective The ability of cell sheet from MSCs to heal critical-size rabbit calvarial defect was evaluated. Methods We harvested MSCs sheets using a continuous culture method. Histological examination and scanning electron microscopy were performed to evaluate the osteogenic sheets. The cell sheet was then implanted into a 15mm diameter rabbit calvarial defect. The new bone formation inside the defect was investigated by radiographic, histological, and histomorphometric analyses in 8 and 12 week after operation respectively. Results The cell sheets showed evident mineralized nodules, indicating their in vitro osteogenic potential. Radiographic, histological and histomorphometric analyses revealed that the defect treated with cell sheet showed signif i cant bone formation. Conclusion The cell sheet can enhance bone regeneration in healing critical-size rabbit calvarial defect.

bone tissue engineering;mesenchymal stem cells;cell sheet;critical-size calvarial defect

R813

A

1008-6455（2017）05-0023-04

2017-01-18

2017-04-26