野生大豆与栽培大豆杂交F1代ISSR多态性分析

熊振宇 李海波 余爽

摘要[目的]探究野生大豆与栽培大豆之间遗传多态性的差异，以期为大豆杂交育种的亲本选配提供理论依据。 [方法]用20对ISSR引物对野生大豆与栽培大豆及其10份杂种F1材料进行遗传多样性分析，探讨野生大豆与栽培大豆之间的遗传关系。 [结果]此次试验共扩增出167条带，其中121条为多态性带，多态率达72.45 %；杂交F1代材料与其母本中黄19及父本ZYD04350间的平均遗传相似系数分别为0.65和0.47。 [结论]栽培大豆与野生大豆杂交F1代材料间存在着丰富的变异，杂交F1代从母本获得的遗传物质多于父本。

关键词野生大豆；栽培大豆；ISSR；多态性

中图分类号S565.1文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）10-0137-03

ISSR Polymorphism Analysis of F1 Hybrids of Glycine soja and Glycine max

XIONG Zhenyu，LI Haibo，YU Shuang*（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan，Hubei 430000）

Abstract[Objective] To sudy the difference of genetic polymorphism between Glycine soja and Glycine max，so as to provide theory evidence for Glycine max crossbreeding. [Method] Twenty primers were used for ISSR analysis on Glycine soja，Glycine max and 10 F1 hybrids，to study the genetic relationship of Glycine soja and Glycine max. [Result] Total 167 bands were amplified in the PCR reactions.Among them 121 were polymorphic bands and the polymorphic rate was 72.45%.The average genetic coefficients between Zhonghuang 19 and F1 progenies，ZYD04350 and F1 progenies were 0.65 and 0.47，respectively. [Conclusion]There was abundant genetic variation among F1 progenies derived from crossing between Glycine soja and Glycine max，

genetic material of F1 hybrids obtained from maternal was more than male parents.

Key wordsGlycine soja；Glycine max；ISSR；Polymorphism

大豆（Glycine max）作为重要的油料和粮食作物，在世界范围内得到了广泛种植。随着栽培大豆品种推广年限的延长，品种间的遗传基础日益狭窄，变异幅度逐渐变小，优异性状不断丢失[1-2]。因此优良种质资源的挖掘创新显得十分重要。

野生大豆（Glycine soja）作为栽培大豆的祖先，在长期的自然选择过程中，形成了极其丰富的变异类型，具有许多栽培大豆无法比拟的优势：①野生大豆富含蛋白质，是一种高蛋白植物。徐豹等[3]、杨光宇等[4]研究表明，野生大豆的蛋白含量明显高于栽培大豆，平均含量可达45.4%，最高达55.4%。②野生大豆单株荚数较多，种子繁殖系数较高。王克晶等[5-6]研究发现栽培大豆中一般种质每株荚数都在100个以下，而在野生大豆中一般每株荚数可达400～500个，甚至上千个。③野生大豆具有抗逆性强、适应范围广的特点。目前，相关学者已鉴定出抗旱、抗涝、抗盐碱等对逆境胁迫有较强抗性的野生大豆材料[7-8]。同时对于野生大豆在抗灰斑病、蚜虫、大豆胞囊线虫病、花叶病毒等生物胁迫方面也有相关报道[9-10]。野生大豆作为栽培大豆的近缘野生种，两者之间不存在种间杂交障碍和遗传隔离，故可以通过杂交技术将优良野生大豆资源引入到栽培大豆育种研究中，这对大豆遗传基础的拓宽，优良新品种的选育等起到极其重要的作用[11-14]。

伴随着分子生物学的发展，遗传多样性的检测已从传统的表型标记、同工酶标记发展到分子标記。AFLP、RFLP、RAPD等分子标记技术都在检测植物遗传多样性研究中得到应用，但都存在一些缺点。AFLP分子标记操作较为繁琐、耗时；RFLP分子标记技术需用到同位素，对人体伤害较大；RAPD分子标记技术稳定性差。而ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，简单序列重复区间）分子标记技术是 Zietkiewicz等[15]发明的，与其他分子标记相比，具有适用范围广、成本低、操作简单、稳定性高和多态性丰富等特点。目前，ISSR分子标记技术在油菜[16]、水稻[17]、茶树[18]、小麦[19]和百合[20]等植物的遗传多样性分析、基因定位、种子纯度鉴定等研究中得到了广泛利用。利用ISSR分子标记技术探讨野生大豆与栽培大豆杂交F1代植株与其亲本间遗传多态性的差异，以期为大豆杂交育种的亲本选配提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料。试验材料为中黄19（栽培大豆）、ZYD04350（野生大豆）及其10个杂交F1代植株，材料名称见表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取。选取盛花期大豆植株顶部幼嫩的叶片，液氮保存。总DNA的提取采用CTAB法[21]，并根据大豆自身特点加以改良。DNA质量检测采用1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.2 ISSR-PCR反应体系的建立。ISSR-PCR反应体系为2×PCR mix 12.5 μL，ISSR引物（10 ng/μL）2 μL，DNA模板（10 ng/μL）2 μL，补水至25 μL。反应程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，循环30次；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3琼脂糖凝胶电泳检测。利用20对多态性引物对试验材料进行筛选，扩增产物利用2%琼脂糖凝胶电泳检测，100 V电压条件下电泳，直至标记染料完全跑出（约1 h）。电泳结束后于凝胶成像系统内分析、拍照。

1.3数据分析将琼脂糖凝胶电泳图根据条带的有无转化为0/1数据（有条带的记1，无条带的记0），利用NTSYSpc2软件分析材料间的遗传相似系数和构建聚类树状图。

2结果与分析

2.1DNA质量检测CTAB法提取植物材料叶片DNA，1%琼脂糖电泳检测结果如图1所示， 所提DNA条带清晰，无杂质、无降解，质量较高，可以用于后续试验。

2.2ISSR-PCR扩增利用20对ISSR引物对野生大豆与栽培大豆及其10个杂交F1代进行扩增，各引物扩增的带数及多态性条带数目如表3所示。共得到167条带，其中引物B2扩增带数最多，为15条，引物B9和B15最少，为5条，平均每个引物扩增条带8.15条。其中多态性条带121条，多态率为72.45%。图2是引物B2的PCR扩增产物电泳图。

2.3亲本及杂交F1代遗传相似系数分析试验利用20对ISSR引物对2个亲本及其10个杂交F1进行多态性分析，将电泳结果转化为0/1数据，并利用NTSYSpc2软件进行遗传系数分析，其结果如表4所示。2个亲本间的遗传相似系数最小为0.35，子代材料A1与A9之间遗传相似系数最大为0.87。10个子代单株与母本的遗传相似系数在0.55～0.71，平均遗传相似系数为0.65。子代单株与父本间的遗传相似系数在0.38～0.53，平均遗传相似系数为0.47。

2.4亲本及杂交F1代聚类分析 根据遗传相似系数矩阵进行UPGMA聚类分析，结果如图3所示。通过聚类图可知，群体被分为二大类，第1类为父本，第2类为母本及杂交F1代单株，其可分为母本P1和杂交F1代二大亚支，在杂交F1代亚支中，又分为3个分支，第1分支包括A1、A9和A10，第2分支包括A2、A8、A3和A4，第3分支包括A5、A6和A7。亲本P1与P2被分在二大类中，在聚类图中距离最远，说明双亲野生大豆与栽培大豆存在着不同的遗传背景。母本与所有杂交F1代被分在第二大类中，说明杂交F1代与母本间的亲缘关系更近。从图3可以看出，母本P1、父本P2和所有杂交F1代分别处于3个亚支中，暗示在亲缘关系上，杂交F1代之间比其与双亲间更近。

3结论与讨论

该研究利用ISSR分子标记分析野生大豆与栽培大豆及其F1代的遗传多态性差异，结果表明ISSR分子标记具有较高的多态性。其扩增产物检测无须利用复杂繁琐的聚丙烯酰胺凝胶电泳，2%琼脂糖电泳即可很好地分辨，操作简单，方便快捷。因此，ISSR作为一种良好的分子标记技术，在分子标记辅助育种和遗传多样性检测等研究中有广阔的前景[22]。

该研究中，杂交F1代及双亲在遗传相似系数上有较大差异。亲本野生大豆与栽培大豆间遗传相似系数为0.35，为所有试验材料中最小，说明野生大豆与栽培大豆间存在着遗传多样性的差异。另外，各子代材料与父本及母本的平均遗传相似系数分别为0.47和0.65，低于父母本之间遗传相似系数，暗示着子代材料已融合双亲遗传物质。

通过双亲及杂交F1代的遗传相似系数及聚类分析图可以发现，杂交F1代存在不均等的获得双亲遗传物质的现象，这种不均等性表现为杂交F1代能更多地得到母本的遗传物质。一个可能的原因是杂交F1代获得母本的细胞质遗传物质——线粒体及叶绿体基因。但在刘梦培等[23]的研究中，利用ISSR分子标记分析3个杂交组合及其子代的遗传变异中仅有1个组合出现这种现象，说明此种现象不只是由细胞质遗传造成的，还可能存在其他原因。同时在生产上将优良种质作为母本配制杂交组合，子代有更大几率获得更多母本的优良性状，对杂交育种中的亲本选配工作具有积极的作用。

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