江苏省宿迁地区猫弓形虫流行病学调查和分析

李崎川 贾传礼

DOI：10.3969/j.issn.2096-3637.2017.10.007

摘要：為了解江苏省宿迁地区猫弓形虫病的感染情况，分别采用粪便检查、PCR组织检测及IHA血清检测等方法对该地区家养猫和流浪猫开展弓形虫流行病学调查。粪检结果未发现弓形虫卵囊，但显示该地区猫感染主要肠道寄生虫是猫弓首蛔虫及等孢球虫；采用PCR及IHA方法检测发现，猫弓形虫病平均感染率分别为22.64%和35.85%；2种方法弓形虫阳性符合率为52.63%（10/19），阴性符合率达94.12%（32/34）。调查表明，宿迁地区猫弓形虫感染较为广泛，相比家养猫，流浪猫弓形虫感染率更高，但2种方法检测流浪猫与家养猫弓形虫感染率差异均无统计学意义（P > 0.05）。

关键词：弓形虫；猫；粪检；PCR；IHA；江苏

中图分类号：S858.293 文献标识码：B 文章编号：2096-3637（2017）10-0009-02

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种可感染包括人在内所有温血动物，并呈世界性分布的专性细胞内寄生原虫。研究表明，孕妇感染弓形虫后可导致早产，流产，胎儿发育畸形等，人感染弓形虫的重要途径之一是猫感染弓形虫后排出的卵囊。而随着宠物行业的发展，流浪动物数量的不断增多，人与犬、猫等动物的接触日益频繁，使得人感染弓形虫的风险也随之日益加大。为了解宿迁市猫的弓形虫感染情况，同时为猫源性弓形虫病的预防和控制提供依据，本研究于2017年3月至6月期间对该地区家养猫及流浪猫进行了弓形虫感染状况调查及相关因素的研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂与仪器

PCR Buffer、d NTP、Taq酶等均购自TaKaRa公司；蛋白酶K、RNase购自上海生工生物工程公司；弓形虫抗体间接血凝（IHA）检测试剂盒（批号20170508203），购自中国农业科学院兰州兽医研究所；引物合成由华大基因公司完成。酚、氯仿、异戊醇等均为国产分析纯。EDC-810 PCR扩增仪，NANODROP 2000分光光度计（Thermo公司）等。

1.1.2 实验动物及虫株

2017年3月～6月期间，收集来自江苏省宿迁市及周边地区的53只成年猫，其中包括17只家养猫和36只流浪猫。弓形虫RH株，为国际公认的标准I型强毒株，其基因组DNA被提取后，由本室于-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1粪便检查

所有成年猫单笼饲养，采集各猫的新鲜粪便样品，若粪便不能当日检查，则应放在4℃普通冰箱或阴冷处，以抑制虫卵的发育及粪便发酵。所有粪样逐一编号，避免交叉污染。

采用饱和糖盐水漂浮法检查各猫是否在排弓形虫卵囊。取2～5g粪便，加入适量的饱和糖盐水充分搅拌均匀，用60目的金属筛过滤入试管中。3000 rpm离心后，继续滴加饱和糖盐水至液面微凸起，取盖玻片直接盖上，并保证其与液面完全接触，静置5 min后，镜检。如此方法，连续检查3d，以防漏检。如发现弓形虫卵囊则迅速收集培养并保存。

1.2.3血清及组织样品采集

对所有猫采集血液后，分离血清，于-20℃保存备用。同时采集各猫脑、心肌、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、淋巴结等组织，用于基因组DNA的提取。

1.2.4组织DNA的提取

20～50mg组织剪碎，每管分别加入10%SDS 50 μL，0.5 M EDTA 25 μL，5 M Nacl 10 μL，1 M Tris-HCl 10 μL，20 mg/mL蛋白酶K 5 μL，ddH2O 400 μL，混合均匀后于37℃水浴4～8 h。随后采用经典的酚-氯仿法提取猫各组织的基因组DNA，分光光度计测定DNA样品浓度及纯度后，-20℃保存备用。

1.2.5弓形虫PCR方法检测

合成以弓形虫529bp重复序列为靶基因的引物片段，F：5-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3，R：5-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3。反应体系为：1×PCR缓冲液、2.5 mM Mg2+、100 μM dNTP、0.3 μM上下游引物、1 U TaqDNA聚合酶、模板1 μL、加无菌双蒸水至总体积25 μL。反应条件：94℃预变性3 min；94℃ 30 s，58℃ 30s，72℃ 45 s，35个循环；最后72℃ 10 min。每次反应分别设阳性和阴性对照，产物经1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.2.6 血清检测

参照商品化试剂盒操作指南采用IHA方法对所有动物血清样品进行检测。在阳性对照血清滴度不低于1：1024，阴性对照除第1孔（可能存在前滞现象）外，其余各孔及空白孔均未发生红细胞凝集的前提下，血清稀释度≧1：64判定为阳性，对处于临界值或可疑的血清样品，则进行重复检验。

1.2.7 数据分析

采用SPSS 20.0软件中独立样本及配对资料卡方检验对猫弓形虫病感染情况做统计分析，并以P < 0.05表示样本间显著性差异，同时对各影响因素做必要的风险评估（OR）。

2 结果

2.1粪便检查

饱和糖盐水漂浮法连续3d检查所有成年猫只的粪便样品，未镜检到弓形虫卵囊，但在部分粪便样品中发现有猫等孢球虫卵囊（20.75%，11/53）、弓首蛔虫卵（28.30%，15/53）以及毛尾线虫卵（3.77%，2/53）。

2.2 PCR检测

PCR方法检测发现，宿迁地区猫弓形虫病平均感染率为22.64%。其中家养猫检测阳性率为11.76%；流浪猫阳性率27.78%。统计结果显示流浪猫与家养猫弓形虫感染率无显著性差异（P > 0.05）（表1）。

表1 宿遷地区成年猫弓形虫感染率

表2 PCR检测猫各组织弓形虫检出率

对所有猫各组织DNA样品进行PCR检测发现，脑与肺脏组织弓形虫检出率最高，均达15.09%，相比心肌、肾脏及肝脏组织，两者弓形虫检出率均显著更高（P < 0.05），且风险系数是其他组织的3.86倍（表2）。除此之外，脾脏、淋巴结组织则均未检测到弓形虫的存在。

2.3 血清检测

IHA方法检测猫血清结果显示，宿迁地区猫弓形虫病平均感染率为35.85%。家养猫与流浪猫弓形虫检测阳性率分别为29.41%，38.89%。统计结果表明流浪猫与家养猫弓形虫感染率差异无统计学意义（P > 0.05）（表1）。

2.4 两种方法弓形虫检测结果的符合率

两种不同方法检测弓形虫感染结果的符合率见表3。综合检测结果显示，两种方法阳性符合率较低，仅为52.63%，阴性符合率较高，达94.12%。同时统计分析表明，无论流浪猫还是家养猫，两种方法弓形虫检测结果均无显著性差异（P > 0.05）。两种检测方法结合，该地区成年猫弓形虫感染的综合阳性率达39.62%（21/53），其中流浪猫感染率为44.44%（16/36），家养猫为29.41%（5/17），但采用卡方检验统计显示两者差异并不显著（P > 0.05）。

表3 两种不同方法检测猫弓形虫感染的符合率

3 讨论

国内外对猫粪便检查情况已有相关报道。本文对宿迁地区成年猫进行粪便检查，发现猫等孢球虫及弓首蛔虫是该地区猫感染的主要肠道寄生虫。这一结果与国内其他地区猫肠道寄生虫病的调查结果一致。文中显示，猫弓首蛔虫卵检出率最高（28.30%），而国内外其他地区猫弓首蛔虫的感染率也较高。猫既是弓形虫生活史的终末宿主，也是其中间宿主，有报道指出猫首次感染弓形虫时可在7～20d之间排出大量卵囊 。但当猫再次感染时则主要作为弓形虫感染的中间宿主，这可能是在成年猫粪便中难以检测到弓形虫卵囊的重要原因。

据之前报道，我国不同地区猫弓形虫感染率在10.3%～63.2%之间。而本文对宿迁地区成年猫的弓形虫检测阳性率达39.62%。这些结果表明猫弓形虫病流行十分广泛，且存在地区差异。对猫各组织DNA进行PCR检测结果显示，脑及肺脏弓形虫检出率最高，这提示我们隐性感染是该地区猫感染弓形虫的主要方式。本文中，相比家养猫，流浪猫弓形虫感染率略高，但两种检测手段的结果显示，家养猫与流浪猫弓形虫感染率差异并不显著（P > 0.05），而这一结果与崔丽丽的报道并不完全一致，同时多个地区的研究结果均显示，流浪猫相比家养或宠物猫，其弓形虫感染率更高。究其原因，这主要与猫的生活习性有关，流浪猫由于常在户外觅食，食入被弓形虫污染的食物的机会要比家养猫大得多。

PCR方法已广泛应用于动物弓形虫病的流行病学调查，基于不同靶基因建立的PCR检测方法也逐渐应用于临床诊断中，本文中对2种方法弓形虫检测结果的符合率进行分析发现，PCR方法弓形虫检出率低于血清学方法，而在Li 的研究报道中也得到相同的结论。血清学方法存在假阳性率高，无法排除母源抗体干扰等缺点，而PCR方法同样存在假阳性以及易污染的问题。在无法获得动物组织样品的情况下，血清学检测方法更适用于较大规模流行病学的研究，而在应用于动物弓形虫病的临床诊断时，2种方法可适当选择，或互补应用。

参考文献

[1]刘广伟，崔庆庆，高雪婷等.唐山市犬、猫肠道寄生虫感染情况调查[J].中国病原生物学杂志，2011，6（07）：562-563.

[2]陈彦锦，曹娥，杨松萍等.滇池周边猫粪便内寄生虫感染的调查[J].昆明医学院学报，2012，33（S1）：166-168.