枳壳挥发油化学成分及其抑菌活性分析

梁卉 刘绍华 欧阳坚 闻婧 刘昌福 李运华

摘要[目的]比较分析枳壳与麸炒枳壳挥发油成分及其抑菌活性差异。[方法]采用水蒸气蒸馏法提取枳壳、麸炒枳壳的挥发油，并通过GC-MS分析枳壳与麸炒枳壳挥发油的化学组成；采用滤纸片法研究枳壳与麸炒枳壳挥发油的抑菌活性。[结果]枳壳挥发油中主要化学成分相对含量高于麸炒枳壳；枳壳和麸炒枳壳挥发油对试验菌均具有抑制活性，但麸炒枳壳挥发油活性较优。[结论]枳壳与麸炒枳壳挥发油的抑菌活性可能与其主要化学成分含量差异有关。

关键词枳壳；麸炒枳壳；挥发油；化学成分；抑菌活性

中图分类号R285.5文献标识码A文章编号0517-6611（2017）11-0111-03

Abstract[Objective] The research aimed to compare chemical composition and antibacterial activity of essential oil from Fructus aurantii and stirbaked Fructus aurantii.[Method]The essential oil of Fructus aurantii and stirbaked Fructus aurantii was extracted by steam distillation method，and the chemical composition of essential oil from Fructus aurantii and stirbaked Fructus aurantii was analyzed by GCMS.The antibacterial activities of essential oil from Fructus aurantii and stirbaked Fructus aurantii were studied by filter paper method.[Result]The main chemical composition relative content in essential oil of Fructus aurantii was higher than that of stirbaked Fructus aurantii.The essential oil of Fructus aurantii and stirbaked Fructus aurantii were resistant to the tested bacteria，but the antibacterial activity of essential oil from stirbaked Fructus aurantii was better.[Conclusion]The antibacterial activity of Fructus aurantii and stirbaked Fructus aurantii may be related to the difference of its main chemical composition.

Key wordsFructus aurantii；Stirbaked Fructus aurantii；Essential oil； Chemical composition；Antibacterial activity

枳壳为芸香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）及其栽培变种的干燥未成熟果实。《中国药典》2015年版记载：枳壳味苦、辛、酸、性微寒、归脾、胃经，具有理气宽中、行滞消胀之功效，用于胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂等症[1]。枳壳的功效成分主要为挥发油和黄酮苷类成分。枳壳为常用的中药理气药之一，通常以枳壳或其炮制品麸炒枳壳入药，广泛应用于中医临床[2] ，且麸炒枳壳的药性较枳壳的药性缓和。《日华子本草》记载枳壳治“健脾开胃，消痰……霍乱泻痢，破症结痃癖……利大小肠，皮肤痒……”。以往文献对枳壳挥发油的研究多集中在化学成分分析[3-7]，有关枳壳挥发油的抑菌活性研究较少，且对枳壳炮制品麸炒枳壳挥发油成分及其抑菌活性研究也不多。笔者拟通过比较分析枳壳与麸炒枳壳中挥发油的主要化学成分与抑菌活性差异，为深入研究江西省道地药材枳壳提供基础，同时也为解决细菌对抗生素的耐药性、寻求天然副作用较小的中药抗菌活性成分提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试药材。枳壳和麸炒枳壳于2016年秋季购买于江西省樟树中药材市场，为商州枳壳。由萍乡市中医院潘昌明副主任中药师鉴定为枳壳和麸炒枳壳，凭证标本保存于萍乡市卫生学校生物医学研究中心标本馆。

1.1.2供试菌种。试验所需的大肠杆菌 （Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌 （Staphylococus aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidi）和白色念珠菌（Candida albicans）均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3试剂。无水硫酸钠（分析純，广州化学试剂厂），正己烷（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.1.4培养基。细菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司，配方为：牛肉膏 5 g、NaCl 5 g、蛋白胨 10 g、琼脂20 g，以蒸馏水定容至1 000 mL，pH 72。真菌培养基为沙保氏培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.5仪器。挥发油提取装置，电子天平（ML203E，瑞士梅特勒托利多公司），7890A气相色谱-5975C质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1枳壳挥发油提取。枳壳和麸炒枳壳药材粉碎过26目筛，取50 g粉末样品，置于1 000 mL的圆底烧瓶中，加入500 mL蒸馏水浸泡过夜；安装水蒸气蒸馏装置，通入冷凝水；加热至沸腾，保持沸腾6 h后，停止加热；冷凝后，收集挥发油；无水硫酸钠干燥，过滤；称重，计算枳壳和麸炒枳壳中挥发油含量（挥发油重量占粉末样品重量的百分比），得出枳壳和麸炒枳壳的挥发油含量分别为8.0和4.5 mL/kg。枳壳挥发油颜色为深黄色，呈橙果肉香味；麸炒枳壳挥发油颜色较枳壳挥发油颜色浅，呈橙果肉香味且夹杂焦味。

1.2.2GC-MS分析。以色谱纯正己烷将枳壳和麸炒枳壳挥发油分别溶解后，采用石英毛细管气相色谱质谱联用仪分析。色谱条件：色谱柱为HP-5MS石英毛细管柱（5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm×0.25 μm）；进样口温度280 ℃；柱温45 ℃保持3 min，以2 ℃/min升至80 ℃并保持1 min，然后以5 ℃/min升至120 ℃并保持1 min，最后以15 ℃/min升至260 ℃；载气为氦气，流速为1 mL/min，进样量1 μL，分流比10∶1。质谱条件：EI-MS，离子阱温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，接口温度260 ℃，质量范围50～400 amu。

1.2.3枳壳挥发油抗菌活性测定。

1.2.3.1菌体悬液及含菌平板的制备。供试菌制成1011～1012 CFU/L均匀的菌悬液，将融化的灭菌培养基倾入无菌培养皿中，待凝固后滴入0.1 mL菌悬液，用无菌涂布环将菌悬液涂布均匀即成含菌平板，待用。

1.2.3.2抗菌活性的测定。采用滤纸片法[8]：取吸水力较强而质地均匀的滤纸，用打孔器打成直径6 mm 的圆形滤纸片，置洁净干燥的培养皿中，干热灭菌后备用。在每个含菌平皿呈正三角放入3张已灭菌的滤纸片，再吸取2种待测药品，按照1、3、5、7、9 μL浓度梯度垂直滴加到滤纸片上。细菌在37 ℃恒温正置培养1 h后倒置培养24 h，真菌在37 ℃恒温正置培养1 h后倒置培养48 h，观察抑菌情况，并测量抑菌圈直径。以空白纸片做对照。

2结果与分析

2.1枳壳挥发油化学组成经GC-MS分析后，通过HP MSD化学工作站结合NIST11质谱图库对枳壳和麸炒枳壳挥发油各组分质谱数据进行检索与定性，并按峰面积归一化法计算出各组分的相对含量，结果如表1。

从表1可看出，枳壳炮制前后挥发油中共鉴定出了13种主要成分。该13种化合物分别占枳壳和麸炒枳壳挥发油化学成分相对含量的99.42%和99.30%，其中枳壳挥发油中含量较高的为柠檬烯、γ-松油烯和邻异丙基甲苯，其相对含量分别占挥发油化学成分的84.258 4%、5.119 1%和4.460 1%；麸炒枳壳挥发油中含量较高的为柠檬烯、γ-松油烯和邻异丙基甲苯，其相对含量分别占挥发油化学成分的81.536 7%、3.997 8%和8.278 7%。

2.2枳壳挥发油的抑菌活性由表2可知，枳壳与麸炒枳壳挥发油对试验细菌和真菌均有抑制效果，但抑菌强度有一定差异；二者对同一细菌和真菌的抑菌作用存在差异，且麸炒枳壳挥发油的抑菌活性强于枳壳挥发油的抑菌活性。其中，枳壳挥发油和麸炒枳壳挥发油对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性较强，对大肠杆菌和表皮葡萄菌的抑菌活性次之，对白色念珠菌的抑菌活性较弱。

3小结与讨论

（1）枳壳与麸炒枳壳挥发油中均含有13种主要成分，但各化学成分含量有差异，其中柠檬烯、γ-松油烯和邻异丙基甲苯是枳壳与麸炒枳壳中含量较高的成分，柠檬烯有镇咳、祛痰、抗菌的作用[2，9] 。枳壳挥发油中的柠檬烯、γ-松油烯相对含量高于麸炒枳壳挥发油中的柠檬烯、γ-松油烯的相对含量，这可能与枳壳和麸炒枳壳药性强弱有关。但麸炒枳壳挥发油中的邻异丙基甲苯相对含量高于枳壳挥发油中邻异丙基甲苯的相对含量，由于邻异丙基甲苯具有芳香气味，可能是引起枳壳炮制前后气味变化的成分之一。

（2）枳壳挥发油和麸炒枳壳挥发油均为深黄色，但枳壳挥发油的颜色较麸炒枳壳挥发油颜色深，且枳壳挥发油的提取率远高于麸炒枳壳。结合挥发油成分的GC-MS分析结果，麸炒枳壳挥发油中一部分化合物的相对含量低于枳壳，另一部分化合物的相对含量高于枳壳。其原因可能是枳壳经过高温炮制过程中易挥发的化合物有所损失，从而导致其相对含量减少；而高温炮制过程中可能促进另一部分成分发生结构变化，这也可能是引起枳壳挥发油与麸炒枳壳挥发油颜色差异的原因。

（3）根据试验结果，可推测枳壳挥发油和麸炒枳壳挥发油对革兰氏阳性菌的抑制活性强于其对革兰氏阴性菌的抑制活性，对细菌的抑制活性強于其对真菌的抑制活性；枳壳挥发油和麸炒枳壳挥发油中均含有对试验菌有抑制作用的化学成分，但炮制后的麸炒枳壳挥发油的抑菌活性高于枳壳挥发油的活性，其原因是否与枳壳在炮制过程中高温导致挥发油化学成分结构发生变化有关，还需进一步深入研究[10]。

参考文献

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