基于ITS的我国桑科植物分子系统学研究

刘玲 陈仁芳 陈祥平 范小敏 柯皓天 吕银 杜国良

摘要[目的]基于ITS序列初步探讨我国桑科植物的分子系统学。[方法]测定33份桑科材料的ITS序列，通过最大简约法分析它们的分子系统学，并将分析结果与经典分类做比较。[结果]在原始类群和单系类群的确定上与经典分类基本一致；“刺桑、叶被木、圆叶刺桑与桑属的亲缘关系近”这一结果与经典分类不一致。[结论]该研究为我国桑科植物的系统学分析积累了分子生物学资料。

关键词桑科植物；ITS序列；分子系统学

中图分类号S888文献标识码A文章编号0517-6611（2017）12-0126-04

Abstract[Objective] To analyze molecular phylogeny of Moraceae in China based on ITS. [Method] The ITS sequences of 33 individuals were determined， and the molecular phylogeny was alalyzed by maximum parsimonious.Then we compared the results of the analysis with the classical classification. [Result] The determination of primitive and monophyletic groups is basically consistent with the classical classification. The result showed that Taxotrophis ilicifolius， Streblus taxoides， Taxotrophis aquifolioides were close to Morus Linn. is not consistent with the classical classification. [Conclusion] This research had accumulated molecular biology data for the classification of Moraceae in China.

Key wordsMoraceae；ITS sequence；Molecular phylogeny

桑科植物的分类最早可追溯到1753年林奈的《植物种志》[1]，随后Moretti等[2]、Seringe等[3]、Bureau等[4]、Koidzumi等[5]都对桑科植物的分类进行了研究。我国植物分类学家陈嵘在《中国树木分类学》中将我国桑科植物分为6属[6]。胡先骕[7]在《植物分类学简编》中将桑科植物分为2亚科。《中国植物志》采用Engler（1936年）系统将桑科植物分为3亚科12属[8]。 2002年吴征镒等[9]提出被子植物的一个“多系-多期-多域”新分类系统，以此为依据在《中国被子植物科属综论》中将桑科植物分为5族12属，并将大麻亚科提升为大麻科。张宏达[10]在《种子植物系统学》中将桑科植物分为2亚科8属，同样将大麻亚科提升为大麻科。

目前，关于桑科的分子系统学研究仅见Zerega等[11]利用26S rDNA和葉绿体ndhF基因序列研究了美洲桑科植物的分子系统发育。而我国桑科植物的分子系统学研究鲜见报道。

高等植物核糖体DNA内转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）位于18S、5.8S和26S基因之间，由于不加入成熟的核糖体，受到的选择压力较小，进化速度较快，在被子植物中相对长度具有保守性，适用于属间、种间的系统发育分析[12-14]。该研究收集我国33份桑科材料，以北美蚁栖树属蚁栖树（Cecropia peltala Linn.）为外类群，测定它们的ITS序列，用最大简约法分析我国桑科植物的系统发育关系，初步分析我国桑科植物的分子系统学，为我国桑科植物分类积累分子生物学资料。

1材料与方法

1.1材料

试验材料取自海南、广西、云南、贵州、重庆、四川、新疆等地（表1），采集各样品叶片，材料经鉴定核实无误后采回。

1.2方法

1.2.1DNA提取与质量测定。

DNA提取采用稍加改进的CTAB法[15]，从约0.15 g硅胶干燥的嫩叶中提取，DNA的质量和浓度用1%琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测，电泳时用λDNA作Marker；电泳完成后用凝胶成像系统拍照。

1.2.2PCR扩增与测序。

PCR反应体系共20 μL，包括DNA模板（10 ng/μL）1 μL，10×PCR Buffer 2 μL，Mg2+（2.5 mmol/L）1.6 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.6 μL，正反向引物（50 ng/μL）各1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.15 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR反应扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，55℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共33个循环；72 ℃延伸7 min，最后10 ℃保存。扩增引物ITS5：5′—GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG—3′，ITS4：5′—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3′[16]，测序由上海生物工程技术服务有限公司完成。

1.3数据分析

测序结果用Sequencher4.1.4软件拼接，对少数误判碱基根据碱基峰形进行更正。利用ClustalX 1.83c软件[17]进行序列比对，根据GenBank公布的菩提树（Ficus religiosa，AY063582）18S rRNA基因3′端碱基序列attgtcga，5.8S基因的5′端碱基序列aagaacg，3′端碱基序列acacgcc，26S rRNA基因5′端碱基序列aacgcgaac，确定34份材料的ITS及ITS1、5.8S、ITS2的序列范围。用Bioedit软件除去非ITS序列。用DNAstar软件分析ITS序列长度、GC含量。用PAUP Ver.4.0b10软件[18]基于最大简约法分析进化关系。

2结果与分析

2.1ITS序列长度、GC含量由表2可知，34份材料的ITS长度在574～651 bp，GC含量在54.22%～66.03%；ITS1长度在223～283 bp，GC含量在52.73%～69.75%；5.8S长度在124～169 bp，GC含量在52.23%～58.06%；ITS2长度在204～236 bp，GC含量在53.71%～70.51%。

2.2基于ITS的进化关系

用PAUP Ver.4.0b10软件最大简约法分析供试材料间的进化关系，构建的系统发育树参数如下：树长（Tree length）为2 060，一致性指数（Consistency index，CI）为0.552 4，保持性指数（Retention index，RI）为0.656 9，调整后的一致性指数（Rescaled consistency index，RC）为0.362 9。序列比对共693个位点，其中74个不变位点，189个变异非信息位点，430个信息位点。

分支图首先将外类群蚁栖树分出，接着分出的是葎草，自检支持率Bootstrap为100%，后面依次是藤构、楮、构树、牛筋藤。剩余材料分为两大支，Branch 1和Branch 2。Branch 1包括榕属，见血封喉，鹊肾树，自检支持率Bootstrap为54%。Branch 2首先将假鹊肾树分出，接着分出的是细齿水蛇麻、葨芝、柘树，自检支持率Bootstrap为73%。波罗蜜属和桑属分别聚为1支，支持率为100%。圆叶刺桑、刺桑、叶被木聚为1支，自检支持率Bootstrap为97%，并且它们与桑属聚在一大支，支持率为100%。

3结论与讨论

（1）构属和牛筋藤属是原始类群。

分支图紧接外类群分出的是构属的藤构、楮、构树和牛筋藤属的牛筋藤。根据外类群确定法，认为构属和牛筋藤属为原始类群。

《中国植物志》将桑科分为3亚科、7族、12属，桑亚科是第1亚科，认为该亚科是原始类群。构属和牛筋藤属分别是桑亚科的族3构树族的第3、4属，族1、族2分别是水蛇麻族和桑族，它们比族3更原始；《中国被子植物科属综论》中，桑族是桑科的第1族，属于原始类群，桑属、构属、牛筋藤属是其前3属。因此，在原始类群的确定上该研究与经典分类基本一致。

（2）榕属、波罗蜜属、桑属为单系类群，鹊肾树属为非单系类群。

分支图将榕属、波罗蜜属、桑属分在一个分支，认为这3个属是单系类群；与2种经典分类一致。

鹊肾树属的鹊肾树、假鹊肾树、叶被木、刺桑、圆叶刺桑分在不同分支，认为鹊肾树属为非单系类群。2种经典分类都将鹊肾树属分为5组。组1.鹊肾树组（Sect.Streblus），2种：鹊肾树、米扬噎（Streblus tonkinensis）；组2.叶被木组（Sect.Phyllochlamys），1种：叶被木；组3.假鹊肾树组（Sect.Pseudostreblus），1种：假鹊肾树；组4.尾叶刺桑组（Sect.Taxotrophis），我国1种，尾叶刺桑（Streblus zeylanicus）；组5.刺桑组（Sect.Pseudotrophis），我国2种，双果桑（Streblusmacrophyllus）、刺桑。《海南植物志》将假鹊肾树命名为Pseudostreblus indicus，将叶被木命名为Phyllochlamys taxoides，将刺桑命名为Taxotrophis ilicifolius[17]，从这些同种异名也可以看出鹊肾树属为非单系类群。

因此，基于ITS的研究结果对单系类群的确定与经典分类一致。

（3）见血封喉与榕属的亲缘关系近，细齿水蛇麻与柘属的亲缘关系近，刺桑、叶被木、圆叶刺桑与桑属的亲缘关系近。

分支图中，见血封喉与榕属聚在一支，说明它们的亲缘关系近。在《中国植物志》中，见血封喉族和榕族分别是族6和族7。在《中国被子植物科属综论》中，见血封喉族和榕族分别位于族3和族4。因此，2种经典分类都支持这一结果。

分支图将细齿水蛇麻与柘属分在一个分支上，表示它们的亲缘关系近。在《中国植物志》中，细齿水蛇麻属于族1水蛇麻族，柘属处在族5波罗蜜族，认为它们的亲缘关系較远；而在《中国被子植物科属综论》中，柘属和细齿水蛇麻分别属于桑族的第5、7属，系统位置较近。因此，该结果支持吴征镒等的观点。

2种经典分类都认为桑属是原始类群，刺桑、圆叶刺桑和叶被木都属于族4.鹊肾树族鹊肾树属。桑属和鹊肾树属虽然都在桑亚科或者桑族，但它们的系统位置有一定距离。因此，2种经典分类都不支持刺桑、叶被木、圆叶刺桑与桑属的亲缘关系近。

参考文献

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