牛源性成分核酸检测方法研究进展及技术标准分析

周李华 马丽侠 李怀平 孙登峰 沈兴中 叶德萍 刘明东

摘 要：牛肉制假、掺假问题严重侵害消费者权益，影响进出口贸易。目前，基于DNA序列特异性以动物物种之间遗传信息的差异作为物种鉴定检测靶标的核酸检测方法已被广泛应用。该文综合论述牛源性成分核酸检测技术的研究进展，并对其发展趋势进行讨论。同时对牛源性成分检测的国内现行技术标准的适用范围、检测方法、检出限等进行详细分析，以供相关执法部门和广大检测工作者参考，为制修订牛源性成分检测技术标准提供理论依据。

关键词：牛源性；核酸；PCR；技术标准

文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2017）12-0050-08

Abstract： Beef fraud， adulteration problems seriously violates the health and interests of the consumers， even influences import and export trade. The nucleic acid detection method based on the DNA sequence specificity that uses genetic information among different animal species as a detection target of species identification has been widely used. This review summarizes the advances in nucleic acid detection techniques available for bovine derived material and discusses the development trend. At the same time， the applicable range， detection method and detection limit of the current China detection standards for bovine derived components were analyzed. In detail for reference by the relevant law enforcement departments and the majority of inspection workers， and lay the foundation for the revision of the technical standards for detection of bovine derived components.

Keywords： bovine derived； nucleic acid； polymerase chain reaction； technical standards

0 引 言

动物源性成分广泛分布于食品、饲料、化妆品等，与人们的生活息息相关，其中食品和饲料所占比例最大。中国是世界上人口最多的国家，也是世界动物源性食品和饲料的生产和消费大国。统计数据显示，2015年，我国牛肉产量达到700万吨[1]。自2004年以来的世界性疯牛病、禽流感、羊搔痒病，以及2013年涉及欧洲l6国的马肉风波等事件曝光以来，肉及肉制品掺假成为世界各国共同关注的热点问题[2]，肉食品及其饲料的安全隐患直接关系到人类的安危[3]。为保护消费者权益，全球不同国家和地区对肉制品的标识要求都做了不同程度的规定。欧盟定量成分声明（quantitative ingredient declaration，QUID）强制要求肉制品需要标识出所有成分及其净含量，详细规定了净含量的计算方法[4]。美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）食品标签指南规定肉制品中需要标识出所有成分，并在食品外包装的主展示面上根据质量按照降序羅列所有成分。《中华人民共和国食品安全法》第六十七条规定，预包装食品的包装上应当有标签，标签应当标明名称、净含量、成分或者配料表等事项。

综上所述，各国已有肉制品标识的法律法规来约束生产者和经营者的行为，但要保障相关法规的有效执行，还需要借助科学精准的检测方法，完善技术标准体系。本文就目前牛源性成分检测的主流技术——核酸检测方法[5]的研究进展进行分析和总结，同时对国内牛源性成分检测现行技术标准状况进行了梳理，并对该领域的未来发展方向进行了探讨。

1 牛源性成分检测方法研究进展

近几十年来，以核酸为标志物的动物种类鉴别检测方法飞速进步，并获得了广泛应用。常用于动物源性成分的核酸检测方法主要包括核酸杂交，聚合酶链式反应（PCR）技术及衍生方法，实时荧光PCR技术，以及近年来发展起来的数字PCR技术，液相芯片技术，DNA条形码技术等。

1.1 核酸杂交技术

早期研究中多用DNA杂交完成动物源性成分鉴定，该方法将用放射性同位素标记的动物全基因组DNA物种特异性探针与固定到尼龙膜上的样品DNA进行杂交，根据产生的放射信号鉴定样品的物种组成。利用这种方法对加工过的牛肉和猪肉的混合制品[6]进行同源性鉴定，得到了良好的效果。但由于方法耗时长、有放射性、对DNA的纯度要求高，探针信号的强度常受到样品组织来源或其加工方式等因素的影响，且灵敏度不高，定量困难，因此在实际应用中受限。

1.2 常规PCR技术

常规PCR技术是相对于荧光定量PCR技术而言的，该技术是核酸检测的基础技术。其突出特点是具有很高的灵敏度，是传统形态学方法、基于代谢物的检测方法以及基于蛋白的检测方法不可比拟的。这在检测加工牛肉制品和饲料中的牛源性成分时极为重要。该技术不仅可用于分辨动植物种类，也用于动物的品种鉴别和身份识别，并广泛应用于肉类的溯源体系。欧盟、加拿大、澳大利亚等国家都相继建立肉类溯源管理系统。当肉制品发生污染时，对其DNA标记进行检测可以快速地追溯到它的亲本和产地等来源信息。此法用于牛源性成分鉴定的目的基因通常位于线粒体上，可用于生鲜牛肉和烹煮牛肉等的测定，检出限一般在1%以下，部分见表1。

在常规PCR基础上延伸发展起来的有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、聚合酶链式反应-随机扩增多态性DNA（PCR-RAPD）、微卫星标记检测法（SSR）等技术。PCR-RFLP结合了RFLP与PCR技术的特点，通过限制性内切酶识别双链DNA分子的特定序列，然后利用指纹图谱对形成的长度不等的限制性片段进行多态性分析的技术[29]。该技术的缺点是操作中DNA用量大，纯度要求高，DNA的污染（如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度盐）均能抑制酶切活性；此外，由于操作环节多、周期长、容易受到目标基因序列中酶切位点随机突变的影响，易产生检测结果的不确定性，如有些酶由于受旁侧核苷酸甲基化的影响，导致在特异位点的切割效率降低，限制了RFLP技术的应用。PCR-RAPD能够检测多个基因位点，无须预先知道被研究生物基因组的核苷酸序列，因此此法不仅是鉴定家畜，而且是鉴定稀有物种（未知来源）的有效手段。Saez等[30]运用PCR-RAPD技术可以从加工过的食品中，鉴定出猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、火鸡肉等成分。但由于RAPD引物扩增结果差，条带模糊或难以辨认，且随机扩增的重现性差[31]，该技术在动物源性成分鉴定方面的研究不多。微卫星DNA又称简单重复序列（simple sequence repeats，SSRs），由核心序列与两侧保守的侧翼序列构成，具有种间特异性特点。孙金婷[32]筛选出了适合鉴别牛源性的微卫星标记AF271972、AF271980和AB463，可用于牛源性成分的鉴定。Calvo等[33]筛选出扩增的目的片段为84 bp的微卫星标记X00979，该标记的灵敏度可以达到0.005%。在模拟的生猪肉和生牛肉的混合物中，能检测出0.01%的牛肉，相当于可以检测到的牛DNA的含量在2.5 pg；在模拟的熟猪肉和熟牛肉的混合物中，能检测出1%的牛肉。与其他技术相比，微卫星标记技术特异性高，分布数量广，稳定性好、突变率低，适合大量样品的检测。利用牛的特异性微卫星标记来鉴定牛源性成分是一种新的、经济的尝试方法。

1.3 实时荧光PCR技术

实时荧光PCR技术融汇了PCR技术和DNA探针杂交技术（标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团）。其优点是反应快速简便，检测效率高；特异性强，避免假阳性；灵敏度高。用于动物源性成分实时荧光PCR检测的主要是TaqMan探针和SYBR GreenⅠ染料[34]。此方法是目前牛肉及其制品中牛源性成分检测应用的主要技术，目的基因有在线粒体也有在其他组织，检出限基本能达到0.1%以下，见表1和表2。

多重实时荧光PCR法是在实时荧光PCR技术的技术上发展起来的。可以针对多个核酸，同时扩增出多个扩增曲线的PCR反应，提高了检测效率与检测通量。曾少灵等[35]根据牛、山羊和绵羊线粒体细胞色素b基因序列，设计引物探针，建立了能同时鉴别牛、山羊和绵羊源性成分的三重实时荧光PCR方法，可以在一个PCR反应中同时鉴别牛、山羊和绵羊3种源性成分，检测效率与检测通量得到了很大的提高；杨冬燕等[36]在常规荧光PCR检测一种掺假成分的基础上，成功建立了可以同时检测牛、猪和马，牛、马和鸭，牛、鸭和猪的三重荧光PCR检测体系。多重实时荧光PCR优点是快速、节约试剂，且由于多对引物的存在，能避免假阳性的结果。但设计引物探针时，应注意所有引物探针的Tm值应相近。

1.4 数字PCR技术

数字PCR（digital PCR，dPCR）是近年来发展起来的新技术，是对传统PCR方法的技术革新。它可通过读取荧光信号的有或无进行计数，经过统计学泊松分布的校准进行绝对定量[37]。目前，通过数字PCR技术对肉及肉制品掺假成分进行定性和定量检测的研究才兴起，有少部分学者成功建立了不同动物源性成分的检测体系。Floren等[38]以微滴式数字PCR技术为基础，通过线粒体和核基因的比較，选择以单拷贝的F2基因为靶基因设计引物探针，对牛肉、马肉和猪肉的混合物进行定量检测，定量限为0.01%，检出限为0.001%。苗丽等[39]基于微滴式数字PCR技术，在一定范围内生鲜肉样品的质量与DNA质量、DNA质量与DNA的拷贝数之间均存在线性关系，可以借由此完成DNA的拷贝数与生鲜肉质量的转化，建立了定量检测肉及肉制品中牛肉和猪肉的方法。数字PCR可以对样品进行绝对定量，直接检测出样品中的拷贝数，数据重复性好，而且样本需求较低，与实时荧光定量PCR相比，它不需要建立标准曲线，灵敏度更高。

1.5 液相芯片技术

液相芯片技术利用悬浮在液相中的分类荧光编码微球作为检测载体，提供一种能够充分进行反应的液相环境，它将流式细胞术、激光技术、应用流体学和数字信号处理技术等结合在一起，具有高通量、快速灵敏、特异性强、检测范围广等特点[40-41]。目前，将液相芯片技术应用于动物源性成分检测方面的报道较少。但作为新一代分子诊断技术，液相芯片在食品安全检测、医学诊断、农业检测和环境监测等方面得到了广泛应用[42-44]。

1.6 DNA条形码技术

DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的标准的、有足够变异的、易扩增、片段较短的DNA片段[45]。常用线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COX I）基因的一个特定片段DNA作为动物的条形码[46]。目前，DNA条形码技术的研究已应用于很多禽畜及海洋动物，如鳕鱼[47]、鲶鱼[48]、虾[49]等。王东亮[50]以6种畜禽生鲜肉（牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉和鹅肉）和市售牛肉干作为研究对象，以基因组DNA电泳图、PCR产物电泳图及DNA测序图为评价依据，采用基于COX I基因和16S rRNA基因的DNA条形码技术验证了其在畜禽肉及肉制品种属鉴定中的可行性。研究发现，经过油炸处理后（处理时间小于5 min）的生鲜肉，仍可用DNA条形码方法鉴定种属，且16S rRNA比COX I基因更适合于深加工肉制品种属的鉴定。根据DNA测序图中杂峰的数量判断被测样品掺杂的程度，但无法同时鉴定出混合肉中每种成分的种属。

由DNA条形码技术衍生出来的宏条形码技术结合了DNA条形码技术和高通量测序技术的共同优点，可以获得来自于混合样品中所有目标DNA片段的序列，然后将这些序列与合适的数据库进行比对即可确定其代表的物种，进而可以分析出被测样品中的物种种属[51]。宏条形码技术对于食品类型鉴定，特别是对于未知食品、复杂食品或者深加工食品来说有着非常重要的作用，为科研人员分析物种成分提供了一个新的研究手段[52]，是一种快速、简便与经济的物种鉴定方法。

2 牛源性成分检测现行国内技术标准分析

目前我国用于牛源性成分检测的现行技术标准有14项，其中国家标准共有5项（含1项即将发布的标准），行业标准6项，地方标准1项，农业标准1项，商业标准1项。本文就每项标准的适用范围、目的基因、检出限等进行了梳理，见表3。

SN/T 1119——2002《进出口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法 PCR方法》[62]是我国出入境检验检疫行业第一个用于检测动物源性饲料的标准，主要适用于动物源性饲料中牛源性成分的检测。GB/T 20190——2006《饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法》[53]不仅仅适用于动物源性饲料，也适用于以植物为主要基质的配合饲料和浓缩饲料，适用范围比SN/T 1119-2002中的广。NY/T 1946——2010《饲料中牛羊源性成分检测实时荧光聚合酶链反应法》[65]适用于动物源性饲料、配合饲料、浓缩饲料及精料补充料中的牛源性成分，适用范围比SN/T 1119——2002、GB/T 20190——2006广，采用实时荧光PCR法，方法也更先进、快捷，检出限为0.1%。GB/T 21103——2007《动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法》[54]适用于动物源性饲料中哺乳动物源性成分的检测，采用多重PCR方法，在同一反应管内对牛、绵羊、山羊、猪、兔、鹿、马、驴、狗和猫等哺乳动物同时进行扩增，适用于鉴定含有未知成分的样品，但是当样品检测结果为阳性时仅仅能判定为含有哺乳动物源性成分，而检测不出具体的动物源性成分。GB/T 21104——2007《动物源性饲料中反刍动物源性成分（牛，羊，鹿）定性检测方法 PCR方法》[55]主要适用于动物源性饲料中反刍动物-牛、羊、鹿的源性成分检测。

SN/T 2980——2011《动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法》[59]实用性较广，适用于肉品、奶品、饲料、生皮、动物油脂等多种动物产品的牛源性成分检测。与山羊、绵羊、鹿、马、驴、猪、猫、狗、兔、鱼、鸡、鸭、鹅、鸽子、火鸡、鸵鸟等动物之间特异性良好，不存在交叉反应。该标准单一荧光PCR检测和多重实时荧光PCR检测都可以应用，并且多重与单一荧光PCR检测的检测限一致，比GB/T 20190——2006大约灵敏10倍，即0.025%[35]。SN/T 2557——2010《畜肉食品中牛成分定性检测方法实时荧光PCR法》[58]主要适用于新鲜肉、冷冻肉和深加工食品中牛源性成分的定性检测，如肉干、肉酱、火腿、肉松等，检出限为0.1%。与马、猪、野猪、兔、猫、鸡、火鸡、比目鱼、大比目鱼9种动物之间特异性良好，不存在交叉反应，但与鹿科动物和绵羊存在交叉反应。灵敏度方面新鲜肉的检测限为0.01%，即0.02 ng；而对于深加工食品（比如罐头肉）的灵敏度则较低，为0.1%[25]。

SN/T 2051——2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法-实时PCR法》[57]适用于食品、化妆品和饲料中牛源性成分的鉴别检测，用双标记荧光PCR技术，根据线粒体 COX I基因上动物种间多态性的差异进行牛羊源性成分鉴定，可以在一次PCR反应中实现对样品中猪牛羊源性成分的定性检测，测定底限为0.1%。宝生物工程（大连）有限公司将该标准方法开发成牛源性成分实时荧光PCR检测试剂盒（货号No.RR910）。该标准无需电泳，简单快速，但价格较高，按照标准要求，每个样品需设置2～3个平行反应体系及阳性对照、阴性对照、空白对照，原价平均40元/次，做1个样品需要花费200～240元，对于经费充裕的实验室来讲是个不错的选择。启封新的试剂盒后，注意分装，-20 ℃保存。运用该标准检测酱牛肉、肥牛卷、牛肉干、牛肉松、牛排、牛肉馅饺子等中的牛源性成分，结果显示除了3份假冒牛肉外，其余样品均可检测出牛源性成分，说明标准适用范围较广[28]。

SN/T 3730.7——2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第7部分：水牛成分检测实时荧光PCR法》[60]适用于食品和饲料中水牛成分的定性检测，适用对象较单一，只针对水牛，未涉及到黄牛、牦牛等其他牛的成分，在一定程度上使用受限。SN/T 4397——2015《出口食品中牦牛源性成分的检测方法实时荧光PCR法》[61]只适用于肉及肉制品中牦牛源性成分的定性检测。在九龙牦牛、青海高原牦牛、麦洼牦牛、甘南牦牛、巴州牦牛、斯布牦牛、中甸牦牛、嘉犁牦牛8個牦牛品种中稳定性表现一致；与山羊、绵羊、猪、鸡、黄牛、水牛、驴、马、兔9种动物之间特异性良好，不存在交叉反应[66]。SB/T 10923——2012《肉及肉制品中动物源性成分的测定实时荧光PCR法》[64]主要适用于鲜（冻）肌肉组织或经过初步加工的鲜（冻）生肉制品，不适用于深加工的肉制品，适用范围较窄。地方标准SZDB/Z268——2017《动物产品及饲料中黄牛、水牛和牦牛源性成分实时荧光PCR检测方法》[63]的适用范围是动物产品和饲料，不仅可以检测单一源性成分，也可以用三重实时荧光PCR同时检测黄牛、水牛和牦牛源性成分。

《动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法》即将发布，其基于DNA条形码技术，根据样品类型选择基因条码引物，制定了涵盖常见哺乳类、禽类、鱼类动物的肉、乳、血液、毛发、角骨、内脏、皮张等来源的动物制品及饲料物种的Sanger测序方法标准，该方法通过一次实验，就可以高通量、快速、准确地完成对未知动物成分和混合样品成分的定性检测，为动物成分的真伪提供一些依据，解决动物制品掺假比较难以测出的难题。相对实时荧光PCR方法，该方法流程较多，成本偏高。

3 結束语

各国学者近年来基于各类技术平台研究肉制品中动物种类的定性定量检测方法，大致可分为形态学方法、基于代谢物的检测方法以及基于蛋白、核酸的检测方法。随着食品掺假、制假水平的提高及样本量大、频次高、时效性强的食品抽检，急需一些快速、准确、灵敏的筛查方法。核酸检测方法因准确、快速、灵敏度高、特异性好而广泛应用于动物源性成分的检测。尽管近年来实时荧光PCR技术在牛源性成分及其他动物源性成分定性定量检测中发挥着举足轻重的作用，但是相关方法的完善和推广仍然面临着诸多挑战。由于不同动物样品性别、年龄、组织器官和肌肉类型等的DNA总量，特别是线粒体DNA总量存在很大差异，另外样本不同，不同组织DNA提取难度和提取纯度也不一样，使得较难确定标准样品，并且扩增的靶序列不同，PCR反应效率之间的差异也会对检测结果产生影响，阻碍方法的标准化进程。数字PCR技术等新技术为动物源性成分检测开辟了新的途径。但是在已建立的数字PCR定量检测方法中DNA的拷贝数与肉的质量分数转化方面还有待研究。

随着分子生物学的发展，动物源性成分的检测技术也在不断完善和创新，正向着高灵敏度、高特异性、高通量、自动化和低成本的方向发展。以动物作为原料的食用性制品的生产和消费在我国国民经济中占据重要地位，随着食品质量安全监管水平的不断提升、消费者维权意识的不断加强，进一步研究开发快速、准确、高效、多组分动物源性成分检测方法是未来的发展趋势。在技术标准方面，目前牛源性成分检测技术国家标准主要适用于饲料，无法用于食品检测。现有行业标准等涉及食品中的动物源性成分检测存在交叉重复性，需要经过进一步验证、归拢、整理。多技术多方法可选，多参数多成分可测的基础性通用技术标准的研制更能有效地推广实施。

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（编辑：莫婕）