枯草芽孢杆菌subtilisstr.168双精氨酸途径分泌蛋白预测及功能分析

朱德全 韩诚武 尹红

摘要[目的]对枯草芽孢杆菌subtilis str.168双精氨酸转运途径（Tat）分泌蛋白进行预测和功能分析。[方法]从NCBI中选取枯草芽孢杆菌subtilis str.168基因组注释的蛋白质氨基酸序列，然后用SignalP 4.0、LipoP、TatP、TMHMM 2.0软件分析该基因组中双精氨酸途径的分泌蛋白，同时采用COG功能数据库对预测的分泌蛋白进行功能注释和聚类分析。[结果]通过分析发现108个有motif没有酶切位点的Tat信号肽蛋白、25个有酶切位点没有motif的Tat信号肽蛋白、124个既有酶切位点也有motif的Tat信号肽蛋白，其中105个蛋白归为Tat途径的分泌蛋白。[结论]对枯草芽孢杆菌Tat途径分泌蛋白的基因组预测和功能分析，将为分析该菌胞外蛋白的分泌机制打下基础。

关键词枯草芽孢杆菌；分泌蛋白；双精氨酸分泌途径；功能分析

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2017）30-0128-03

Abstract[Objective]Prediction and functional analysis of secreted proteins of TwinArginine Translocation （Tat） pathway Bacillus subtilis str.168 were conducted. [Method]The genome sequences of B.subtilis subsp. subtilis str. 168 were used to predict to secretory proteins of Tat pathway and functional analysis. SignalP 4.0， LipoP， TatP， TMHMM 2.0 were used to predict secretory protein of Tat pathway. Function of secretory proteins was also analyzed by COG （Cluster of Orthologous Groups of proteins） database. [Result]There were 108 Tat signal peptides proteins containing motif without cleavage site of enzyme， 25 proteins containing cleavage site of enzyme without motif， 124 proteins containing cleavage site of enzyme and motif.105 proteins were classified as proteins secreted by Tat pathway in these proteins. [Conclusion]These results will lay the foundation for analyzing the secretion mechanism of extracellular protein in B. subtilis.

Key words Bacillus subtilis；Secreted proteins；Tat secretion pathway；Function analysis

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）为革兰氏阳性菌，它们对外界有害因子抵抗力强，能抑制有害菌的生长繁殖，且保湿性强，为土壤的保护膜，可以防止肥分及水分流失，并能产生多种生理活性物质及其他容易被环境利用的养分[1]，适用于有机肥、堆肥的制作。在环境和水体净化、防治水稻稻瘟病以及医疗中发挥重要作用。2006年NCBI数据库上收集的芽孢杆菌种名有182个，有的分类系统将芽孢杆菌分为20多个属。

细菌的分泌蛋白在介导菌体与宿主细胞黏附定殖、与外界环境相互作用方面扮演重要的作用[2]。细菌蛋白质在细胞内合成后，通过不同的途径跨膜分泌到细胞外。双精氨酸转运（ Twinarginine translocation，Tat）途径是另外一个蛋白分泌跨膜转运系统，该系统的特征是在分泌蛋白的信号肽中含有一个高度保守的双精氨酸基序[3]。Tat途径的优点是它只分泌已正确折叠的蛋白，从而保证了分泌产物在结构上的正确性[4]。该研究从NCBI中选取枯草芽孢杆菌subtilis str.168基因组注释的蛋白质氨基酸序列，然后用SignalP 4.0、LipoP1.0、TatP、TMHMM 2.0软件分析该基因组中的Tat分泌蛋白及其功能，有助于分析芽孢杆菌对外界环境产生相应环境效应的机理，为今后对其功能的具体研究以及对环境管理保护提供数据基础。

1材料与方法

1.1材料

下载美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank公布的芽孢杆菌细菌基因组序列，GenBank的登录号是NC_000964.3。

1.2方法

1.2.1Tat途径分泌蛋白的分析和统计。

采用SignalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）和LipoP1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/）软件分析该菌株的Sec途径分泌信号肽的蛋白。利用TatP软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TatP）预测Tat途径分泌信号肽的蛋白。同时利用软件TMHMM 2.0 （http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测分析蛋白的跨膜螺数。只有TatP软件预测为阳性，同时SignalP 4.0和LipoP1.0预测为阴性，并且跨膜螺旋数≤1才被归类为Tat途径的分泌蛋白。

1.2.2Tat途径分泌蛋白功能分析。

统计Tat途径分泌蛋白，同时采用COG功能数据库（http：//eggnog.embl.de/）对分析得到的分泌蛋白质进行功能注释和聚类分析。

2结果与分析

2.1芽孢杆菌Tat途径分泌蛋白分析

先后使用4种软件对枯草芽孢杆菌subtilis str.168基因组4 157个蛋白进行Tat途径分泌蛋白的预测分析[5]。由表1可知，没有酶切位点的Tat信号肽的蛋白有108个，有酶切位点没有motif的Tat信号肽蛋白有25个，有酶切位点也有motif的Tat信号肽蛋白有124个，其中有酶切位点也有motif的Tat信号肽蛋白中跨膜螺旋数≤1的Tat途径分泌蛋白为105个。同时对它们的基因编号、蛋白名称、蛋白长度、COG功能以及酶切位点进行分析，结果见表2。

2.2芽孢杆菌基因组Tat途径分泌蛋白功能分析

分析结果表明有酶切位点也有motif的Tat途径分泌蛋白个数为105个，其中具有COG功能注释的蛋白有96个。这些有功能注释的Tat途径分泌蛋白，主要与氨基酸代谢和转运，蛋白质翻译后修饰，能源产生和转换，核糖体的结构和生源有关[6]。

3讨论

分泌蛋白是微生物吸收营养物质、适应外界环境并与宿主发生相互作用的物质基础。尽管Sec途径是细菌中蛋白分泌跨膜转运的主要途径，但是Tat途径只转运折叠正确的蛋白质，产物更加稳定[5]，具有较强的现实意义，目前一些具有工业价值的重组蛋白已通过Tat途径实现有效的分泌表达[7]。

芽孢桿菌是较早完成分泌蛋白预测的细菌，总共发现301个分泌蛋白，占基因组总数的7.3%。芽孢杆菌的分泌蛋白类型和数量都比较多，可能与适应土壤微生物环境有关[6，8]。对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168基因组Tat途径分泌蛋白的预测和功能分析有助于了解该菌株适应外界环境的分子机制，也为该菌株目标蛋白的高效表达提供新的途径。分析结果发现通过Tat途径分泌的含有信号肽蛋白有258个，约占全部基因的10.1%，但既有酶切位点又含motif的蛋白为124个，占基因组编码蛋白的3.0%，这与其他菌株的比例相似。

对Tat途径分泌蛋白的功能分析发现，这一途径分泌蛋白的功能主要与氨基酸运输和代谢，蛋白质转译后的修改，能源生产和转换，核糖体的结构和生源有关。这将有利于该菌株适应外部环境。

参考文献

[1] RANE A N，BAIKAR V V，KUMAR V R，et al.Agroindustrial wastes for production of biosurfactant by Bacillus subtilis ANR 88 and its application in synthesis of silver and gold nanoparticles[J].Front Microbiol，2017，8：492.

[2] LIU C，ZHANG Z Y，DONG K，et al.Adhesion and immunomodulatory effects of Bifidobacterium lactis HN019 on intestinal epithelial cells INT-407[J].World journal of gastroenterology，2010，16（18）：2283-2289.

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[4] MLLER M.Twinargininespecific protein export in Escherichia coli[J].Research in microbiology，2005，156（2）：131-136.

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[6] VAN DIJL J M，BOLHUIS A，TJALSMA H，et al.Protein transport pathways in Bacillus subtilis：A genomebased road map[M]//SONENSHEIN A L，HOCH J A，LOSICK R，et al.Bacillus subtilis and its closest relatives：From genes to cells.Washington，DC：ASM Press，2002：1-3.

[7] 向燕，李建光，关梅，等.好氧氨氧化微生物生态学研究进展[J].贵州农业科学，2012，40（9）：115-120.

[8] TJALSMA H，BOLHUIS A，JONGBLOED J D H，et al.Signal peptidedependent protein transport in Bacillus subtilis：A genomebased survey of the secretome[J].Microbiology and molecular biology reviews，2000，64（3）：515-547.