不同病毒感染方法对山羊体细胞重编程效率的影响

宋辉 李卉 王锋

摘要[目的]检测2种病毒感染方法（悬浮感染和贴壁感染）对体细胞重编程效率的影响。[方法]采用慢病毒作为载体携带多能因子分别使用悬浮感染和贴壁感染2种方法感染正常山羊体细胞，统计克隆形成率。[结果] 悬浮感染和贴壁感染的平均克隆率分别为0.44‰和0.31‰，悬浮感染的效果要显著地优于贴壁感染。[结论]悬浮感染的方式更利于山羊成纤维细胞重编程。

关键词诱导性多能干细胞;病毒;重编程效率

中图分类号S852.65+4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）32-0089-02

Effects of Different Virus Infection Methods on Reprogramming Efficiency of Goat Somatic Cells

SONG Hui1，2，LI Hui1，2，WANG Feng2*

（1.Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance，Ningxia Medical University，Ministry of Education，Yinchuan ，Ningxia 750004;2.Jiangsu Engineering Technology Research Center of Meat Sheep & Goat Industry， Nanjing Agricultural University， Nanjing，Jiangsu 210095）

Abstract[Objective] To study the effect of two kinds of virus infection methods （suspension infection and adherent infection） on somatic cell reprogramming efficiency. [Methods] Lentivirus was used as carrier to carry the pluripotent factor. The somatic cells of normal goat were infected by suspension infection and adherent infection respectively. The colony formation rate was calculated. [Result] The average cloning rate of suspension infection and adherence infection was 0.44‰ and 0.31‰ respectively. The effect of suspension infection was significantly better than that of adherent infection. [Conclusion] The method of suspension infection is more suitable for reprogramming of goat fibroblasts.

Key wordsInduced pluripotent stem cells;Virus;Reprogramming efficiency

體细胞重编程方法主要包括：核移植、细胞融合和诱导性多能干细胞技术（induced pluripotent stem cells，iPSCs）[1]（图 1），而目前最常用的方法是iPSCs技术。但是作为一个新技术仍然存在一些问题，例如重编程的效率低等。该技术从产生至今，尽管研究人员不断对其进行优化，Huang等[2]报道，不论是人类细胞还是小鼠细胞，不论使用2、3或4個因子进行诱导，VPA都可以有效地提高重编程的效率。VPA与腺病毒和质粒转染的方法相结合，能否提高重编程的效率仍值得进一步探索。

最近的研究也已经表明，在重编程过程中转基因的表达只需要在开始的10～12 d[3-4]，表明游离病毒载体携带的外源转录因子已经足够重编程体细胞。因此，该研究尝试在病毒感染的初期使用2种感染方法：悬浮感染和贴壁感染，检测是否对体细胞重编程效率产生影响，从而为山羊成纤维细胞重编程提供指导。

1材料与方法

1.1主要试剂

DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）、血清替代物（KSR）、非必需氨基酸（NEAA）、脂质体（Lipofectamine TM 2000）、胰蛋白酶、谷氨酰胺、β-巯基乙醇（β-ME）均购置于美国Life公司;丝裂霉素-C（MIT-C）购置于瑞士Roche公司;成纤维细胞生长因子（β-FGF）购置于美国Peprotech公司。

1.2方法

1.2.1悬浮感染。用胰酶消化羊耳成纤维细胞，用含有病毒感染液的培养液将细胞吹下。将细胞悬液铺到事先准备好的饲养层上。24 h后将病毒感染液吸出，加入体细胞培养液。24 h后重复感染一次。4 d后，用胰酶消化病毒感染的羊耳成纤维细胞，按一定的比例铺到事先准备好的饲养层上，每天换液，在第6天用ESCs培养基代替体细胞培养基继续培养，直到出现克隆。

1.2.2贴壁感染 感染前，在6孔板的一个孔里铺上羊耳成纤维细胞。待细胞汇合到80%时，加入病毒感染液感染（每孔的感染液为：每种病毒浓缩液按照1∶1∶1∶1的比例加入到1 mL体细胞培养液，混匀）。24 h后将病毒感染液吸出，加入体细胞培养液。24 h后重复感染一次。4 d后，用胰酶消化病毒感染的羊耳成纤维细胞，按一定的比例铺到事先准备好的饲养层上，每天换液，在第6天用ESCs培养基代替体细胞培养基继续培养，直到出现克隆。

2结果与分析

2.1病毒感染前后羊耳成纤维细胞的形态学觀察

图 2A为原代培养的山羊成纤维细胞，中间夹杂着一些卵圆形的上皮细胞，经过传代即可除去混杂的上皮细胞，得到纯度很高的成纤维细胞，在第2～3代进行病毒感染（图 2B：F3代山羊成纤维细胞），图 2C和图 2D依次分别是经过两轮病毒贴壁感染和悬浮感染后的山羊成纤维细胞，由于病毒对细胞的损伤导致部分细胞出现凋亡现象。将病毒感染后的细胞使用胰酶消化后铺到事前准备好的饲养层上继续培養（图 2E和图 2F），不论是悬浮感染还是贴壁感染，一般都会在感染后12～15 d出现克隆（图 2G和图 2H，表 1）。

2.2不同病毒感染方式对克隆形成效率的影响

每种感染方式各做了5次重复试验，每次感染1×105个细胞，悬浮感染和贴壁感染的平均克隆率分别为0.44‰和0.31‰，悬浮感染的效果要显著地优于贴壁感染，使用悬浮感染更利于山羊成纤维细胞重编程。

3结论与讨论

体细胞重编程的过程中，一直面临诱导效率过低的问题，影响因素很多，细胞本身的质量及个体差异对诱导结果会产生一定的影响，诱导后内源基因表达的时间和克隆出现的时间都会存在一定差异，而其中病毒的用量非常重要，用量过大会对体细胞造成严重的伤害，用量过小不足以将体细胞重编程到需要的程度。因此，该试验采用多次重复感染，并配合悬浮感染和贴壁感染2种方法，以期增加iPSCs形成的效率和质量。结果表明悬浮感染平均克隆率为0.44‰，而贴壁感染平均克隆率为0.31‰，悬浮感染的效果要显著优于贴壁感染，但是不论用哪种感染方法，对克隆出现的时间不会有太大的影响，一般是在诱导后12～15 d出现克隆。该研究用形态学标准筛选原代克隆进行扩增[5-6]，iPSCs已经传代超过20代，传代细胞活力旺盛，冻存后快速复苏，其复苏后大部分细胞具有良好的细胞活力。

参考文献

[1] YAMANAKA S.Strategies and new developments in the generation of patientspecific pluripotent stem cells[J].Cell Stem Cell，2007，1（1）：39-49.

[2] HUANGFU D W，MAEHR R，GUO W J，et al.Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by smallmolecule compounds[J].Nat Biotechnol，2008，26（7）：795-797.

[3] STADTFELD M，MAHERALI N，BREAULT D T，et al.Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse[J].Cell Stem Cell，2008，2（3）：230-240.

[4]

BRAMBRINK T，FOREMAN R，WELSTEAD G G，et al.Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells[J].Cell Stem Cell，2008，2（2）：151-159.

[5] TAKAHASHI K，TANABE K，OHNUKI M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell，2007，131（5）：861-872.

[6] KASTENBERG Z J，ODORICO J S.Alternative sources of pluripotency：Science，ethics，and stem cells[J].Transplant Rev（Orlando），2008，22（3）：215-222.