外源绿原酸缓解黑大豆SB铝毒害的机理研究

江晓洁 李芳 王闻闻 陈宣钦

摘要： 该文研究了外源绿原酸（CGA）对Al胁迫下铝敏感型黑大豆SB根生理生化指标以及根中胁迫相关基因表达的变化，探讨外源CGA缓解SB根铝毒害的效果及分子机理。以不同浓度Al和CGA处理SB，筛选出CGA缓解Al毒害的最佳浓度，测定Al含量、抗氧化系统酶活性、1433蛋白与H+ATP酶的表达、H+泵活性。结果表明：低浓度CGA能缓解Al胁迫下黑大豆SB根伸长抑制，并促进侧根数目增加，而高濃度CGA的缓解效果下降；0.01 g·L1 CGA使Al胁迫下SB根尖Al含量与MDA含量下降，促进根系柠檬酸的分泌。RTPCR和Western Bloting分析表明0.01 g·L1 CGA促进Al胁迫下SB根中1433b、1433m、1433k和GHA2基因（质膜H+ATP酶）的表达，抑制MATE基因的表达。同时，0.01 g·L1 CGA能促进Al胁迫下质膜H+ATP酶蛋白磷酸化水平以及其与1433蛋白结合，且能提高质膜H+ATP酶和H+泵活性。因此推测外源CGA可能通过增加侧根数，增强1433蛋白和质膜H+ATP酶基因蛋白表达水平和互作，弥补Al胁迫下MATE表达的抑制，增加柠檬酸的分泌，增强SB对铝毒害的耐受性。

关键词： 黑大豆SB， 绿原酸， 柠檬酸， 1433蛋白， H+ATPase， Al胁迫

中图分类号： Q945.78

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）06073409

Abstract： We investigated the influences of exogenous chlorogenic acid （CGA） on the physiological parameters and Al stressrelated gene expression of SB （Alsensitive black soybean） root under Al stress. A major goal of this report was to explore the alleviating molecular mechanism of exogenous CGA on Al toxicity in SB. SB seedings were cultured in water solution and treated with 50 μmol·L1 Al or CGA plus 50 μmol·L1 Al. The optimal concentration of CGA alleviating Al toxicity was screened. And we study the effects of optimal exogenous CGA on root tip Al content， the activities of antioxidant enzyme， the expressions of 1433 protein and H+ATPase， and the activity of H+ pump under 50 μmol·L1 Al stress. Low concentrations of CGA alleviated inhibition of root elongation caused by Al toxicity and promoted the increase of lateral root numbers under Al stress. However， the CGAalleviated effect was weaken with high concentration of CGA treatment. It was founded that the alleviation effect of 0.01 g·L1 CGA was the most significant. Exogenous 0.01 g·L1 CGA decreased the Al in root tips and MDA contents. And the citric acid content in root exudates of SB under Al stress was significantly increased due to the addition of exogenous 0.01 g·L1 CGA. Expression analysis showed that exogenous 0.01 g·L1 CGA enhanced the expression of three 1433 isoforms （1433b， 1433m， and 1433k） and increased the expression of GHA2 （plasma membrane H+ATPase） gene， but inhibited the gene expression of MATE in SB under Al stress. The results of immunoprecipitation（IP） showed that the phosphorylation of the PM H+ATPase was up regulated by the exogenous 0.01 g·L1 CGA， which could bind with 1433 protein under Al stress. Meanwhile， plasma membrane H+ATPase and H+ pump activities were both enhanced by exogenous 0.01 g·L1 CGA under Al stress. It was suggested that exogenous CGA may enhance the SB tolerance to Al stress by increasing the lateral roots number， compensating inhibition of MATE expression and interaction between them to increase citric acid exudation.

Key words： black soybean， chlorogenic acid， citric acid； 1433， H+ATPase； Al stress

酸性土壤主要分布在热带、亚热带地区和对食物要求量大的发展中国家，约占世界可耕种土壤的30%（Sasaki et al，2004）。酸性土壤中的铝毒害严重抑制农作物生长与产量。铝在土壤pH>7时基本以沉淀形式存在（硅酸盐或氧化物），对植物无毒。当土壤pH<5时，铝则会由沉淀形式转化成为可溶的离子状态，被植物吸收，造成伤害（Delhaize & Ryanp，1995）。氧自由基引起的膜脂氧化损伤几乎是各种逆境胁迫对植物损伤的共同途径和特征。植物体内存在清除氧自由基的酶和非酶抗氧化系统。低浓度Al胁迫下，小麦（孔繁翔和桑伟莲，2004）、水稻（马宝慧，2007）、八仙花（彭尽晖等，2013）、栝楼（周媛，2012）等植物中抗氧化酶活性随着Al3+浓度的增加而升高。耐铝豇豆品种T6 SOD，POD和CAT活性显著高于铝敏感豇豆品种S3（于力等，2012）。在1 000 mg·L1的高铝毒环境下，抗氧化酶会受到不同程度的抑制，抑制作用与植物种类有关。大豆根系中SOD与CAT活性在高浓度Al胁迫下显著下降（刘鹏等，2004）；而同样在1 000 mg·L1Al胁迫下，荞麦根系中SOD活性显著降低，CAT活性有所升高（王保义等，2006）。植物体内存在非酶类抗氧化系统，主要包括各种还原性物质，如还原型谷胱甘肽（GSH）、a生育酚（aTOC）、抗坏血酸（AsA）与类胡萝卜素（CAR）等 （马宝慧，2007）。

铝诱导的有机酸分泌是植物缓解Al毒的最重要途径。在铝毒胁迫下，植物根系有机酸的分泌受H+ATPase、多药耐药毒性物外排转运蛋白（MATE）和1433蛋白等的调控。MATE转运蛋白广泛存在于植物中（梁锋等，2011）。Al胁迫下，高粱与拟南芥根表皮MATE高表达（Chen et al，2012；Liu et al，2009），促进柠檬酸的外转运，缓解Al毒害。质膜H+ATPase与柠檬酸的分泌量也有关。Al胁迫下大豆质膜H+ATPase基因表达上调，根尖柠檬酸的分泌增加，加入钒酸盐（VA，H+ATPase抑制剂）后，H+ATPase活性与柠檬酸分泌量显著下降（Shen et al，2005）。1433蛋白普遍存在于植物中，能与H+ATPase特异结合，促进H+ATPase磷酸化。Al胁迫下，蚕豆根系质膜H+ATPase与1433蛋白的表达上调，H+ATPase磷酸化水平增加，质膜H+ATPase与H+泵活性显著增强，柠檬酸分泌量增加（郭传龙等，2015；Chung et al，1999）。

绿原酸（CGA），又名3O咖啡酰奎尼酸，是一种广泛存在于植物体内酚性成分，是植物有氧呼吸过程产生的一种苯丙氨酸代谢物（林学政等，2005；陈绍华等，2009）。当植物受到生物胁迫时，一方面CGA作为植保素，破坏病原菌细胞壁，直接制剂抑制病原菌的生长（周志娥等，2014）；另一方面，CGA也可转变成为木质素与软木脂，使被入侵的伤口迅速木质化，防止病菌进一步入侵。当植物受到非生物胁迫时，植物体内的CGA含量急剧增加，参与胁迫响应（林学政等，2005）。此外，绿原酸本身作为一种还原剂，对羟基自由基具有清除作用，对植物组织的氧化损伤具有缓解作用（陈绍华等，2008）。目前未见有关绿原酸对Al胁迫下的植物生理生化，生长发育和逆境相关基因表达的影响。

本研究使用水培法，以黑大豆SB（Al敏感型）为材料，研究外源绿原酸对Al胁迫下SB根系相关生理生化指标的影响，探讨SB根中胁迫相关基因表达的变化，揭示外源CGA缓解SB根系铝毒害的生理及其分子机理。

1材料与方法

1.1 材料培养与处理

参照王闻闻等（2014）的方法培养黑大豆SB，3 d后，用含有AlCl3和CGA+AlCl3的营养液（0.5 mmol.L1 CaCl2，pH 4.5）处理幼苗，AlCl3浓度为50 μmol·L1，CGA浓度为0.004 g·L1，0.01 g·L1，0.02 g·L1，0.04 g·L1，并以营养液处理的幼苗为对照，处理24 h、3 d、7 d后，測量根伸长以及侧根数目测定。

将培养的SB幼苗置于处理液（分别含有50

μmol·L1 AlCl3和0.01 g·L1 CGA+50

μmol·L1 AlCl3的营养液）中，以营养液处理为对照。分别处理0、2、4、6、8、12、18、24 h后，取植物的根称重后用于根尖Al含量测定；用液氮处理剩余的植物根后放置超低温冰箱（-80 ℃）保存，用于其它检测分析。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 相对根伸长率及侧根数目的测定处理植物前，对根基部进行标记，并测量比较处理前后从根尖顶端到标记点距离的差异，处理前后测量值之差为根伸长量（周志娥等，2014）。侧根数目的测定：分别计数不同处理前后长度大于1 mm的侧根数目，求其平均值 （王闻闻等，2014）。

1.2.2 根系分泌物柠檬酸收集及含量测定取6只50 mL的开口试管，分别加入10株长势一致的SB幼苗及AlCl3 50

μmol·L1 和CGA（0.004，0.01，0.02，0.04 g·L1）的营养液（0.5 mmol·L1 CaCl2，pH 4.5）中，以营养液（0.5 mmol·L1 CaCl2，pH 4.5）处理为对照。处理24 h后，将样品用真空干燥仪常温下干燥后加入4 mL蒸馏水溶解样品。溶解的样品过阳离子交换树脂提纯，用梯度的硫酸铵洗脱。将洗脱液浓缩回收后1 mL 50%的甲醇溶解过滤，再用HPLC法进行样品柠檬酸含量分析。检测器波长为210 nm，流速0.8 mL·min1，柱温30 ℃，根据峰面积确定样品中的柠檬酸含量 （王闻闻等，2014）。

1.2.3 根尖Al含量的测定将处理过的根用蒸馏水清洗3次，洗净根表面附着的Al，将根表面的水分吸干，装入信封中，再放入70 ℃的烘箱2～3 d后烘干直至恒重。烘干的样品经500 ℃ 高温灰化后，加入1 mL优级纯硝酸浸提过夜得到提取液，提取液用蒸馏水定容至50 mL。用ICPAES测定根中金属Al含量（Lan et al，2016）。

1.2.4 MDA和H2O2含量的测定使用硫代巴比妥法（TBA法）（张志良和瞿伟菁，2003）测定MDA含量。H2O2含量测定使用二甲基酚橙法（李忠光等，2007）。

1.2.5 根尖抗氧化系统酶活性的测定取冷冻保存的样品参照Chen et al（2012）的方法测量根尖抗氧化系统酶（SOD、POD与CAT）活性。

1.2.6 基因表达分析取置于-80 ℃冰箱冻存的SB根尖，于液氮中研磨呈粉末后，加入适量Trizol 试剂 （Invitrogen）提取RNA，使用MMuLV反转录试剂盒合成第一链cDNA。根据质膜中 H+ATPase的编码基因vha2 和 sb1433保守区的cDNA序列，设计合适的引物，以28sRNA为内参（王杰等，2015），参考王闻闻等（2014）所用的引物序列进行RTPCR分析。

1.2.7 免疫共沉淀分析按照Yan et al（2002）的方法提取质膜蛋白，参照Jahn et al（1997）的方法检测SB根系中质膜1433蛋白与H+ATPase的相互作用。20 μg的膜蛋白在 10%PAGE上分离后，用半干转膜法将分离的膜蛋白转至PVDF膜上。电转完毕后，使用质膜 H+ATPase和1433蛋白抗体做一抗进行Western分析，加入二抗观察结果。

1.2.8质膜H+ATPase活性和H+泵活性的测定参照Yan et al（2002）的方法提取质膜蛋白，紫外分光光度计法测定H+泵的活性。

1.3 数据统计分析

使用Prism5和DPS 7.05对数据进行统计分析，并比较显著性差异。

2结果与分析

2.1 外源CGA对Al胁迫下SB根伸长和侧根数的影响

根伸长抑制是Al毒对植物根伤害的最直接表现。根伸长抑制通常通过根相对伸长率（RRG）这一指标反应。本研究在50 μmol·L1 Al溶液中分别加入添加0.004、0.01、0.02、0.04 g·L1 的CGA处理SB幼苗24 h后，测定根长，并与正常的营养液和单独Al处理作为对照，计算根的相对伸长率。图1结果显示，50 μmol·L1 Al处理后，会一定程度抑制了SB根伸长，与正常营养液处理相比，Al处理下SB根相对伸长率（RRG）有所降低。0.01 g·L1 CGA处理下SB的RRG显著高于单独Al处理，甚至高于正常营养液处理，提示0.01 g·L1 CGA处理能缓解Al胁迫诱导的根伸长抑制。其它浓度的CGA处理下根相对伸长率虽然高于单独Al处理，但二者之间并无显著差异。侧根数统计结果表明，处理3 d后，Al胁迫下侧根数显著低于正常对照，Al胁迫除抑制根伸长，还可抑制侧根生长发育。而外源添加0.004、0.01、0.02、0.04 g·L1 CGA处理的SB侧根数目显著高于单独Al处理。除0.04 g·L1CGA处理外，50 μmol·L1Al溶液中分别添加0.004、

0.01、0.02 g·L1 CGA处理下侧根数与正常对照水平相当。处理7 d后，外源添加0.004、0.01、0.02、0.04 g·L1 CGA处理下的侧根数目仍高于单独Al处理，且0.01 g·L1 CGA处理侧根数目高于其它浓度CGA处理。

2.2 外源CGA对Al胁迫SB根尖柠檬酸分泌量的影响

植物根系有机酸分泌外排是植物抗铝毒害的最重要机理。Al处理与对照相比SB根系分泌物中柠檬酸含量显著增加。Al处理下外源添加CGA不同程度增加了Al胁迫下SB根系柠檬酸分泌量。SB根系柠檬酸分泌随着CGA浓度的增加首先呈现先升高的趋势，达到最适的浓度后，就呈现下降的趋势，根据CGA对SB根分泌柠檬酸影响的变化特点，外源0.01 g·L1 CGA处理下柠檬酸分泌量最高，证实该浓度对缓解Al胁迫的效果可能优于其它浓度（图2）。同时，在外源0.01g·L1CGA处理Al胁迫下的大豆根的不管是根伸长长度还是侧根数目均显著高于其他濃度，说明在外源0.01 g·L1 CGA浓度缓解Al对SB胁迫的效果最明显。因此，选择0.01 g·L1 CGA作为其它实验的处理浓度。

2.3 外源CGA对Al胁迫下SB根尖Al含量的影响

0.01 g·L1 CGA单独处理与对照相比，SB根尖Al含量无显著差异。由此可见，CGA本身对根尖Al含量并无显著的影响。50

μmol·L1 Al胁迫下SB根尖铝含量显著高于CGA单独处理和对照。50

μmol·L1 Al胁迫下添加0.01 g·L1 CGA后，根尖铝含量显著低于单独Al处理，说明CGA能显著减少Al胁迫下SB根尖铝的积累（图3）。

2.4 外源CGA对Al胁迫下SB根尖MDA和H2O2含量的影响

Al单独处理使SB根中MDA含量明显提高。外源添加CGA后，Al诱导的MDA含量的升高显著降低，恢复到对照水平，提示CGA对Al胁迫诱导的膜脂过氧化损伤具有缓解作用（图4：A）。Al胁迫和CGA处理，H2O2含量与对照无显著差异，Al胁迫引起的膜脂过氧化，MDA含量增加，并不通过H2O2积累（图4：B）。

2.5 外源CGA对Al胁迫下SB根尖抗氧化酶活性的影响

Al处理后，SB根系可溶性蛋白含量要显著高于对照，推测Al胁迫会促使一些基因过表达；然而在Al胁迫下外源施加CGA后，可溶性蛋白含量虽略高于Al单独处理，但二者之间并无显著差异，CGA并不增加Al胁迫下可溶性蛋白含量 （图5：A）。与对照相比，Al处理下SB根中SOD活性显著降低，CAT和POD活性无显著差异；外源CGA对Al胁迫下SOD、POD、CAT活性没有显著影响（图5）。

2.6 外源CGA对Al胁迫下SB根中1433蛋白、质膜H+ATPase和MATE基因表达的影响

由图6可知，与对照相比，Al胁迫下SB根1433基因表达水平不同程度增强。外源添加CGA后，1433b、1433m和1433k表达水平略高于Al单独处理的植株；而1433c、1433e、1433f、1433g、1433i、1433j和1433n表达水平低于Al单独处理。Al处理下， GHA2mRNA表达水平高于对照，外源添加CGA后，GHA2mRNA表达水平进一步增加，Al胁迫下， MATE基因mRNA水平显著高于对照，与单独Al处理相比，外源添加CGA后MATE基因的表达水平略有下降，但仍高于对照（图6）。

2.7 外源CGA对Al胁迫下SB根中质膜H+ATPase蛋白磷酸化水平及其与1433蛋白互作、H+ATPase活性及H+泵活性的影响

Al处理下，SB根中质膜H+ATPase的磷酸化水平高于对照，外源添加CGA后，SB根中质膜H+ATPase的磷酸化水平进一步增加（图7）。与质膜H+ATPase的磷酸化水平结果相似，Al处理下1433蛋白与磷酸化质膜H+ATPase的结合能力高于对照，添加外源0.01 g·L1 CGA后1433蛋白与磷酸化质膜H+ATPase的结合水平增加，高于单独Al处理和对照。CGA促进了Al胁迫下1433蛋白与磷酸化质膜H+ATPase的结合。

添加外源CGA后，Al处理下SB根中质膜H+ATPase的活性高低依次为Al+0.01 CGA>Al>CK。H+泵活性的结果与质膜H+ATPase活性的结果基本一致，50 μmol·L1 Al溶液添加0.01 g·L1 CGA处理能增强H+泵的活性，单独Al处理下的H+泵活性位于对照组与CGA处理二者之间（图8）。

3讨论

激素在植物应答缓解环境胁迫中起着重要的调节作用，如水杨酸、脱落酸、茉莉酸、乙烯、多肽激素等（徐伟和严善春，2005）。Al胁迫下紫花苜蓿IAA含量显著下降（任晓燕，2013）。CGA是IAA的保护剂，抑制IAA氧化反应，缓解Al胁迫对根系伸长的抑制作用（Paul et al，1964）。本研究中，外源低濃度CGA（0.004和0.01 g·L1 ）缓解Al对SB根伸长具有抑制作用的同时，对侧根的生长发育具有促进作用，而高浓度0.02和0.04 g·L1CGA的缓解和促进效果下降。有机酸分泌是植物抗铝毒害的最重要途径。Al胁迫下，0.01 g·L1 CGA处理后，SB根系柠檬酸的分泌量显著提高，而其它浓度的CGA处理下，柠檬酸分泌量变化并不明显，可见，Al胁迫下，0.01 g·L1 CGA对SB根系具有最显著的缓解作用。此外，我们注意到高浓度0.02和0.04 g·L1 CGA缓解Al毒害的效果下降，推测其可能的原因是被细胞吸收后，糖苷键水解，生成了3，4二羟基苯丙烯酸，其羟基和羧基能电离出H+离子；高浓度CGA被植物细胞吸收后，破坏细胞内环境的酸碱稳态，造成细胞代谢紊乱，因而缓解作用下降。

Al3+诱导植物产生和积累大量的活性氧，破坏正常组织的结构与功能，甚至导致死亡。本研究中，Al胁迫下MDA含量显著增加，暗示Al胁迫引起膜脂过氧化。添加外源CGA后，MDA含量显著下降，CGA能够缓解Al胁迫引起的脂质过氧化。外源CGA和单独铝处理下H2O2的含量与对照无明显差异，Al胁迫引起的膜脂过氧化，MDA含量增加，并不是H2O2的积累氧化造成的。外源CGA和单独铝处理与对照相比，SOD活性显著下降，POD和CAT活性与对照相比无显著差异，CGA对Al胁迫下抗氧化酶活性并无显著的影响和调控作用。CGA分子中具有氢自由基结构，能够清除植物体内的活性氧，减轻自由基对组织的氧化胁迫（胡宗福等，2006）。因此我们推测CGA通过其还原用，清除Al胁迫产生的除H2O2外的其它活性氧，缓解膜脂过氧化，减少MDA的产生。

植物受到Al3+刺激时，根系分泌大量有机酸，如柠檬酸、苹果酸等，这些有机酸能与细胞外的Al3+结合，防止Al3+进入细胞内造成对植物的损害（郭传龙，2013）。柠檬酸通道蛋白属于MATE家族，能转运柠檬酸至胞外，螯合细胞外的Al3+（谢小东等，2011）。本研究中，SB在Al胁迫下，加入0.01 g·L1CGA后，柠檬酸的分泌量虽然显著增加，但MATE表达量却较单独Al胁迫处理略有下降，绿原酸对MATE表达具有一定的抑制效应。可见，绿原酸并不通过上调MATE的表达，增加Al胁迫下SB根系柠檬酸的分泌。结合根伸长抑制试验，0.01 g·L1CGA能显著增加Al胁迫下SB侧根数目。因此，我们推测可能是侧根数目的增多，生物量增加，弥补了MATE的基因表达水平的下降造成的差异，最终使柠檬酸分泌量增加从而缓解Al胁迫。

植物中1433基因家族至少有十五种亚型，这些1433蛋白能与靶细胞不同程度结合，调控植物生长发育和胁迫响应。在酸性土壤中，Al3+进入细胞内，激活1433蛋白，并与H+ATPase特异性结合，使其磷酸化和H+泵活性增加，增强柠檬酸的分泌作用（周志娥等，2014）。与单独Al胁迫相比，CGA处理后的1433蛋白表达各有不同，其中三种1433蛋白（1433b、1433k和1433m）的表达水平均略微上调，而1433c、1433e、1433f、1433g、1433i、1433j和1433n基因表达水平下降。同时与单独Al处理相比，CGA处理后，质膜H+ATPase的磷酸化水平，其与1433的结合能力，H+泵活性均增加。因此，推测CGA还可能通过调控1433蛋白的表达，增加质膜H+-ATP酶的磷酸化水平，增强H+泵的活性使柠檬酸分泌量增加，缓解Al对SB的毒害。至于CGA如果具体调控哪种1433蛋白亚型，需要进一步研究和验证。

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