海南黎药胆木PsbA—trnH—PCR体系的建立与优化

杨卫丽　高新征　邹园生　姚瑰玮　黄静　王勇

摘 要 为了建立适合黎药胆木的PsbA-trnH-PCR体系来研究不同地理居群胆木遗传多样性，本研究以植物基因组试剂盒法提取胆木基因组DNA为模板，采用单因素实验和正交试验对PsbA-trnH-PCR过程中的关键影响因素进行优化，并对PsbA-trnH-PCR产物进行测序鉴定。结果表明，最佳PsbA-trnH-PCR反应体系（25 μL）为：Taq酶1.0 U，dNTPs 0.4 mmol/L，Mg2+ 0.75 mmol/L，引物0.15 μmol/L，模板20 ng，10×PCR Buffer（不含Mg2+）2.5 μL；采用该最佳体系对胆木基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物，经单向测序获得了胆木PsbA-trnH部分序列；并建立了稳定的PsbA-trnH-PCR体系，为胆木的药材鉴别及其遗传多样性研究奠定了基础。

关键词 胆木；PsbA-trnH-PCR；优化系统；正交设计

中图分类号 R284.1 文献标识码 A

Abstract The study intended to establish a PsbA-trnH-PCR system and provide technical support to study the genetic diversity of Li Nationality medicine Nauclea officinalis Pierre ex Pitard in different geographical populations. High quality genomic DNA of N. officinalis Pierre ex Pitard was extracted by the plant genome kit method. The main factors in the process of PsbA-trnH-PCR were optimized by single factor and orthogonal design experiments， and PsbA-trnH-PCR products were sequenced. The results showed that the optimal PsbA-trnH-PCR reaction system（25 μL）was Taq DNA polymerase 1.0 U， dNTPs 0.4 mmol/L， Mg2+ 0.75 mmol/L， primers 0.15 μmol/L， template DNA 10 ng， 10×PCR Buffer（free Mg2+）2.5 μL. The genomic DNA of N. officinalis was amplified using the optimal PsbA-trnH-PCR system to obtain the amplification products， which were sequenced to obtain PsbA-trnH partial sequences. The stable PsbA-trnH-PCR system was established， and can be used in the identification and genetic diversity of for the study of N. officinalis.

Key words Nauclea officinalis Pierre ex Pitard； PsbA-trnH-PCR； optimization of system； orthogonal design

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.020

膽木（Nauclea officinalis Pierre ex Pitard）为茜草科乌檀属植物，入药部位是其干燥茎枝及皮，味苦、寒，具有清热解毒、消肿止痛之功效，我国广西、广东和海南民间常用于治疗感冒发热、肺炎、肠炎、痢疾、湿疹、皮疹和脓疡等疾病，外用治疗痈疖脓肿[1]。胆木也是一味黎族同胞常用植物药，收载于《黎药学概论》[2]。

2009年，生命条形码联盟植物工作组已经决定将叶绿体psbA-trnH基因片段作为植物DNA条形码鉴别的补充条码[3]，其在种间及种下居群间具有进化速率快、变异程度高和区分物种能力较强的特点，适用于药用植物与其近缘种类等较低分类阶元的分子鉴定[4-7]，在众多科属中具有较高的鉴定效率[8-11]，本课题组于前期研究中也验证了该序列较其他推荐序列在药用植物胆木中有较好的鉴别效果。查阅文献可知，目前有关胆木的研究主要集中在成分[12]以及药理方面[13]，在种质研究方面仅见胆木种苗栽培、组织培养[14]和生药学的相关研究[15]。本研究主要是优化和建立了胆木PsbA-trnH-PCR体系，为进一步研究胆木种质资源遗传多样性及胆木药材鉴别研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 采集海南不同产地的胆木新鲜叶片，立即用硅胶干燥，用于提取基因组DNA。

1.1.2 试剂 植物基因组DNA提取试剂盒、dNTPs、Taq酶、Mg2+、DL 2000均为天根产品；西班牙琼脂糖；β-巯基乙醇为成都格雷西亚化学技术有限公司产品；GelRed为Biotium公司产品；引物为华大基因合成。

1.1.3 仪器 手提式高压灭菌器（YX-380D-Ⅰ；华泰）、台式高速冷冻离心机（SIGMA；1-14）、核酸蛋白测定仪（Eppendorf；Biophotometer-puls）、PCR仪[博日；TC-96/T/H（a）]、电泳仪（北京六一；DYY-6D）、凝胶成像系统（Tanon；4100）。

1.2 方法

1.2.1 胆木基因组DNA 依据天根植物基因组DNA试剂盒说明书进行，具体方法如下：（1）取植物新鲜组织200 mg，使用70%乙醇擦洗表面后，加入液氮充分碾磨。（2）取研磨好的粉末100 mg迅速转移到预先装有700 μL 65 ℃预热缓冲液GP1的离心管中（试验前在预热的GP1中加入β-琉基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65 ℃水浴60 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次。（3）加入700 μL氯仿 ∶ 异戊醇（24 ∶ 1），充分混匀，12 000 r/min离心5 min。（4）小心地将上一步所得的上层水相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。（5）将混匀的液体转入吸附柱中，12 000 r/min离心30 s，弃掉废液。（6）向吸附柱中加入500 μL缓冲液GD，12 000 r/min离心30 s，弃掉废液，将吸附柱放入收集管中。（7）向吸附柱中加入700 μL漂洗液，12 000 r/min离心30 s，弃掉废液。（8）向吸附柱中加入700 μL漂洗液，12 000 r/min离心30 s，弃掉废液。（9）将吸附柱放回收集管中，12 000 r/min离心2 min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置5 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液（漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应试验）。（10）将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μL洗脱缓冲液，室温放置5 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中。

最终取所得胆木基因组DNA样品5 μL于0.8%琼脂糖凝胶中电泳30 min，电泳结果用凝胶成像系统观察并照相保存，同时用核酸蛋白分析仪分别于260 nm和280 nm波长下测定胆木DNA样品（稀释50倍）的吸收值，根据核酸蛋白分析仪测得A260/A280的值来判断DNA纯度，同时计算DNA产量。DNA量=A260×稀释倍数（即×50）×DNA总体积，μg。

1.2.2 引物设计 以提取得到的胆木基因DNA为模板，PsbA-trnH为引物，分别为正向引物5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′及反向引物5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。

1.2.3 PCR扩增条件的正交设计 对影响胆木PsbA-trnH-PCR扩增体系的引物、DNA模板、Taq 酶、dNTPs、Mg2+共5个因素4个水平进行了考察（表1），按照L16（45）正交试验表设计试验。10×PCR Buffer统一添加2.5 μL，每个实验组合按表2用量添加，最后补足ddH2O至25 μL，进行PCR扩增。取5 μL PCR扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳25 min，凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。

1.2.4 PsbA-trnH-PCR扩增退火温度考察 采用单因素方法考察退火温度，设置4个退火温度分别为45、50、55、60 ℃，其他因素加入量以正交试验确定最佳PsbA-trnH-PCR实验反应体系为准，取5 μL不同温度PCR扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳25 min，凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。

1.2.5 胆木基因组DNA的PsbA-trnH-PCR扩增

采用正交试验确定的最佳PsbA-trnH-PCR扩增体系，然后以胆木样品提取所得基因组DNA为模板进行PCR扩增。取扩增产物5 μL经0.8%的琼脂糖凝胶电泳25 min，凝膠成像系统观察电泳结果并拍照。

2 结果与分析

2.1 胆木样品基因组DNA提取结果

由图1和表3可知，提取所得的胆木基因组DNA条带明亮整齐，未见明显降解。由此可以确定提取的胆木基因组DNA可用于进行下一步PCR扩增实验。

2.2 PCR扩增条件的确定

根据电泳条带有无、是否清晰明亮、是否存在非特异性扩增条带等作为依据，确定PsbA-trnH-PCR正交设计试验最佳反应体系。由图2可知，PsbA-trnH-PCR 扩增获得16个产物，其电泳结果为：编号为7、12、14的体系扩增结果不理想，其条带不明显或无条带；编号为3、4、8、9、10、11、15、16 的体系可扩增出目标产物，但其非特异性扩增条带较多；编号为1、2、5、6、13 的体系扩增效果较好，目标产物条带清晰，条带之间区分度较好。根据以上分析，初步确定PsbA-trnH-PCR正交设计试验最佳反应体系为编号5，即：模板DNA 20 ng，引物0.15 μmol/L，Taq酶1.0 U，Mg2+ 0.75 mmol/L，dNTPs 0.4 mmol/L，不含Mg2+ 的10×PCR Buffer 2.5 μL，灭菌ddH2O补足至总体积25 μL。

2.3 胆木PsbA-trnH-PCR退火温度优化

考察了45、50、55、60 ℃ 4个退火温度对PsbA-trnH-PCR体系影响，由图3可知，4个退火温度均可扩增出目标产物，60 ℃扩增产物较少，效果不理想，因55 ℃扩增效果最佳，最终确定PsbA-trnH-PCR退火温度为55 ℃。

2.4 胆木的PsbA-trnH-PCR扩增产物分析

根据最优PsbA-trnH-PCR扩增体系扩增而得的产物经测序获得了PsbA-trnH部分序列，其序列长为287 bp，将该序列导入NCBI数据库并进行同源检测，与该数据库中已有胆木PsbA-trnH序列（KP095461.1）进行了相似度考察，其相似度达100%。由此可见，以上确定的PsbA-trnH-PCR扩增体系可准确地扩增出胆木PsbA-trnH序列。本实验结果为今后利用胆木PsbA-trnH序列来研究胆木种质资源的遗传多样性及药材鉴别奠定了基础。

3 讨论

相关研究发现PsbA-trnH序列在植物中进化速率较快，长度适宜，两端存在保守序列，容易设计通用引物，且该片段的引物具有高通用性、高扩增成功率等特点，适用于药用植物及其近缘种类等较低分类阶元的分子鉴定[16]。该片段已广泛地被应用于中药鉴定[17-18]。

目前，关于黎药胆木遗传多样性研究及PsbA-trnH-PCR体系的相关影响因素优化研究尚未见报道；因此，适当调整PCR扩增的主要参数，从而保证胆木PsbA-trnH-PCR扩增结果的稳定性、重复性和可靠性是非常有必要的。本实验采用单因素试验和正交设计方法优化胆木PsbA-trnH-PCR体系，实验结果证实，引物、Mg2+和模板DNA用量Taq酶、dNTPs等均能影响PsbA-trnH-PCR的扩增结果，退火温度对PsbA-trnH-PCR扩增结果影响较小。其中，Taq酶量、引物和Mg2+浓度三者对PsbA-trnH-PCR扩增结果影响较大，浓度过低会导致PCR扩增产物量减少，浓度过高会使PCR扩增产物出现非特异性扩增，从而影响后续测序的准确性。由正交试验设计优化获得PCR扩增反应体系为：DNA模板20 ng，引物0.15 μmol/L，Taq酶1.0 U，dNTPs 0.4 mmol/L，Mg2+ 0.75 mmol/L，不含Mg2+的10×PCR Buffer 2.5 μL，灭菌ddH2O补足至总体积为25 μL。

研究结果表明，可采用单因素试验和正交设计优化胆木PsbA-trnH-PCR反应体系，建立可用于胆木PsbA-trnH-PCR扩增的最佳反应体系。利用该最佳反应体系已成功扩增出胆木的叶绿体部分序列，为今后研究胆木遗传多样性及其药材的鉴定研究奠定了坚实的基础。

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