江苏省渔源性嗜水气单胞菌耐药性分析

刘训猛 方苹 陈静 袁锐 吴亚锋 习丙文

摘要[目的]对江苏省渔源性嗜水气单胞菌进行耐药性分析。[方法] 2014—2015年，对江苏地区渔源性嗜水气单胞菌进行流行病学调查，用API20E试剂条检测嗜水气单胞菌，采用纸片扩散法进行耐药性分析。[结果]共检测到嗜水气单胞菌阳性菌株92份，阳性率为17.79%。对92株嗜水气单胞菌的药敏试验结果表明，在耐药率方面，利福平、新霉素的耐药率>36%，罗红霉素的耐药率>23%，诺氟沙星、庆大霉素、恩诺沙星的耐药率>10%，卡那霉素、氧氟沙星、红霉素的耐药率<9%。在高敏性方面，氧氟沙星>90%，卡那霉素、链霉素>80%，诺氟沙星、利福平、庆大霉素、恩诺沙星>70%，红霉素<30%，新霉素<10%。[结论]在江苏地区嗜水气单胞菌的药物防控中，首选药物为氧氟沙星、卡那霉素和链霉素，应尽量避免使用利福平、新霉素和罗红霉素。

关键词嗜水气单胞菌；抗生素；耐药性

中图分类号S941文献标识码A文章编号0517-6611（2017）08-0110-05

Analysis on Drug Resistance of Fisherysource Aeromonas hydrophila in Jiangsu Province

LIU Xunmeng1，FANG Ping1，CHEN Jing1，XI Bingwen2* et al

（1.Jiangsu Center for Control and Prevention of Aquatic Animal Infectious Disease in Jiangsu Province，Nanjing，Jiangsu 210036；2.Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences， Wuxi，Jiangsu 214081）

Abstract[Objective] To analyze the drug resistance of fisherysource Aeromonas hydrophila in Jiangsu Province. [Method] The epidemiological investigation was made on fisherysource A. hydrophila in Jiangsu Province during 2014-2015. A. hydrophila was detected by using API20E reagent strip. And their drug resistance was detected by using disc diffusion method. [Result] 92 positive strains of A. hydrophila were detected，the positive rate was 17.79%. The results of drug sensitivity test of 92 strains of A. hydrophila showed that the drug resistant rate of rifampin and neomycin were over 36%. The drug resistant rate of roxithromycin was more than 23%. The drug resistance rate of norfloxacin， gentamycin， enrofloxacin were lower than 10%. The drug resistant rate of kanamycin， ofloxacin， erythromycin were lower than 9%. From the hypersensibility，the hypersensibility of ofloxacin was more than 90%，the hypersensibility of kanamycin and streptomycin were more than 80%，the hypersensibility of norfloxacin， rifampicin， gentamycin and enrofloxacin were more than 70%，the hypersensibility of erythromycin was lower than 30%，and the hypersensibility of neomycin was lower than 10%. [Conclusion] In drug prevention and control of A. hydrophila in Jiangsu Province，the preferred drugs were ofloxacin， kanamycin and streptomycin. Rifampin， neomycin and roxithromycin should be avoided to use.

Key wordsAermomnas hydrophila；Antibiotics；Drug resistance

嗜水氣单胞菌（Aermomnas hydrophila）为革兰氏阴性杆菌，在世界各地自然环境中分布较为广泛[1-3]。嗜水气单胞菌在被分离发现的初期，因其非主要致病菌而被忽略。近几十年，嗜水气单胞菌引起人、畜、鱼致病的案例屡见报道，因而受到人类医学、畜牧医学和水产医学界的重视。在人类医学临床上，嗜水气单胞菌可以导致肝胆疾病及恶性肿瘤等免疫功能低者感染发病，且病死率很高[4-5]。在水产养殖中，嗜水气单胞菌可引起多种水生动物的传染病。国内外已有学者做了相关研究报道，从发病的鳊鱼体[6]、急性发病的斑点叉尾鮰[7]、发病的罗非鱼[8]、发病的欧鳗[9]、发病的黄鳝[10]等体内分离的病原均被鉴定为嗜水气单胞菌。其他国内主要鱼类养殖品种，包括两栖类的牛蛙[11]、观赏类的金钱鱼[12]、甲壳类的小龙虾[13]等亦均有报道。笔者以2014—2015年江苏地区养殖渔源性嗜水气单胞菌的流行病学调查为基础，进行分离菌株的药敏试验，分析分离菌株的耐药性和高敏药物，以期为江苏渔源性嗜水气单胞菌的防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

普通营养肉汤培养基、普通营养琼脂培养基、碱性胨水培养基、MH琼脂培养基、药敏纸片，均购自杭州天和生物试剂公司；API20E细菌生化鉴定试剂条由法国梅里埃公司生产。

1.2方法

1.2.1采样。

2014—2015年从江苏省12个县（市、区）每个县（市、区）各选取2个重点养殖厂或养殖户（养殖厂、养殖户的选择以典型品种、养殖面积及品种差异化等原则为主）。每年的3—10月中旬在样品点进行活体采样，未发病的样品点每个样品采样5～10尾，发病样品每个样品采样3～5尾，在发病期将每30 d 1次的采样频次增加到每10～15 d采样1次。共采集样品517份，调查的主要养殖品种有异育银鲫（103份）、草鱼（77份）、鳙鱼（36份）、鲢鱼（31份）、鲤鱼（8份）、鳊鱼（39份）、鲈鱼（12份）、斑点叉尾鮰（15份）、河蟹（83份）、小龙虾（37份）、青虾（26份）、南美白对虾（24份）和罗氏沼虾（26份）。调查的主要采样地点有金坛（40份）、江宁（40份）、通州（39份）、泗洪（35份）、句容（34份）、宝应（43份）、江都（47份）、姜堰（35份）、兴化（49份）、常熟（54份）、大丰（52份）和新沂（49份）。

1.2.2病原分离与鉴定。

将采样样品用75%乙醇体表消毒后进行解剖，无菌采集肝、脾、肾（约0.1 g）及血液和腹腔积液0.1 mL，置于碱性胨水培养液，30 ℃恒温下24 h培养后，各取1接种环培养液置于普通营养琼脂培养基平板上，划线，30 ℃恒温下24 h培養，挑选表面光滑微凸、无色或淡黄色菌落进行纯化。将纯化的菌株转接至普通营养琼脂斜面，4 ℃下保存备用。然后，用API20试剂条进行细菌鉴定。

1.2.3药敏试验。

采用Kirby-Bauer纸片扩散法，对分离并鉴定的嗜水气单胞菌开展10种渔业常用抗菌类药物的敏感性测定，药敏试验具体操作按照抗菌药物敏感性试验执行标准（CLSI/NCCLS-M100-S22 ）[14]方法操作。

从普通营养琼脂培养基上挑取已纯化的菌落，接种于LB液体培养基中30 ℃过夜培养后，用生理盐水将其浓度校正至0.5麦氏标准。然后，用无菌棉蘸取菌液，将管内壁多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂布接种3次，最后沿平板内缘涂抹。将平板在37 ℃下放置5～10 min后，用镊子将药敏纸片紧贴于琼脂表面上，各纸片的距离不小于24 mm，每个平板贴3片，培养24 h后记录药敏圈直径。1.2.4溶血试验。

将92株嗜水气单胞菌，用普通营养琼脂培养基进行复苏培养，划线于血琼脂培养基上，30 ℃下恒温培养24 h，观察各阳性菌株对血琼脂培养基的溶血状况。

2结果与分析

2.1病原分离和鉴定

采用API20E细菌生化鉴定试剂条对采集样品进行鉴定，共分离并纯化嗜水气单胞菌目标菌株92份。检测结果表明，阳性样品92份，阳性率为17.79%。从采样地分布来看，92株阳性菌株分别来源于金坛（4份）、江宁（6份）、通州（6份）、泗洪（4份）、句容（5份）、宝应（7份）、江都（7份）、姜堰（9份）、兴化（14份）、常熟（6份）、大丰（16份）和新沂（8份）。从图1可以看出，各采样地区分离菌株的阳性率为10.00%～30.77%，其中姜堰、兴化和大丰地区分离菌株的阳性率较高，均大于25.00%。

从采样品种来看，92株阳性菌株分别来源于异育银鲫（35份）、草鱼（17份）、鳙鱼（1份）、鲢鱼（6份）、鲤鱼（1份）、鳊鱼（2份）、鲈鱼（2份）、斑点叉尾鮰（4份）、河蟹（12份）、小龙虾（3份）、青虾（4份）、南美白对虾（2份）和罗氏沼虾（3份）。从图2可以看出，各采样品种分菌菌株的阳性率

2.3药敏试验

试验选用10种药敏纸片，测定分离菌株对其药物敏感性和耐药性。由表2可知，92株嗜水气单胞菌对氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类都有耐药株。在耐药性方面，诺氟沙星、卡那霉素、利福平、罗红霉素、庆大霉素、氧氟沙星、链霉素、红霉素、恩诺沙星、新霉素的耐药率分别为

13.04%、8.69%、45.65%、23.91%、10.87%、6.52%、10.87%、5.43%、11.96%和36.96%，其中利福平和新霉素的耐药率大于36%，罗红霉素的耐药率大于23%，诺氟沙星、庆大霉素、恩诺沙星的耐药率大于10%，卡那霉素、氧氟沙星、红霉素的耐药率小于9%（图3）。

在高度敏感药物筛选方面，10种抗生素对92株嗜水气单胞菌的高敏性为：诺氟沙星77.17%、卡那霉素81.52%、利福平73.91%、罗红霉素50.01%、庆大霉素79.34%、氧氟沙星93.48%、链霉素80.43%、红霉素28.27%、恩诺沙星78.25%、新霉素9.79%。

3讨论与结论

抗生素产生耐药性主要有以下危害：①抗生素疗效下降，导致后续剂量加大和用药期延长的恶性循环；②产生耐药性转移，这些残留的抗生素通过农产品，发生药物转移到最终的消费者，日积月累地蓄积在消费者体内，造成对人体病原菌的慢性刺激，诱发人类病原菌对某些抗生素的耐受性；③另一种耐药性转移，消费者食用含有耐药菌的农产品，这些细菌（即使是已经烹饪杀死的耐药细菌），所携带的β-质粒，可以将对某种抗生素的耐药性传递和转移给人类体内的某些致病菌群，从而导致人类被耐药现象，这就是耐药性的种间转移。药物敏感性检测，可以指导渔民精准用药，有效解决水产养殖中抗生素滥用问题，减缓抗生素耐药性产生的进程。

对不同地区、同属不同种的细菌进行药敏试验，可以指导地区从业者有针对性地使用抗生素。笔者对江苏省重点渔业养殖地区、养殖品种中检测到嗜水气单胞菌进行药敏试验，结果表明2014—2015年分离的嗜水气单胞菌对氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类均有耐药株。对卡那霉素、氧氟沙星、红霉素耐药率<9%，可作为治疗水产养殖嗜水气单胞菌病害的防治用抗生素。利福平、新霉素、对罗红霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、庆霉素的耐药率>10%，其中对利福平和新霉素的耐药率>36%。10种抗生素耐药性检测中有70%的抗生素耐药率大于7%，耐药率高于国外文献报道[15]结果，与国内人类医学临床检验报道结果[16]基本吻合，可能与抗菌药的广泛应用有关，应引起国内研究者的重视。在高敏药物筛选方面，氧氟沙星>90%，卡那霉素、链霉素>80%，诺氟沙星、利福平、庆大霉素、恩诺沙星>70%，红霉素<30%，新霉素<10%。在江苏地区嗜水气单胞菌的药物防控中，首选药物为氧氟沙星、卡那霉素和链霉素，应避免利福平、新霉素和罗红霉素的使用。

嗜水气单胞菌分泌的外毒素（Aer）具有细胞裂解性，能引起大多数嗜水气单胞菌产α或β溶血。龚晖等[17]对嗜水气单胞菌Aer溶血特性进行了分析，证实了在单因子条件下嗜水气单胞菌的溶血特性存在一定的差异，嗜水气单胞菌中存在多种溶血性毒素，这些毒素对不同宿主的溶血能力存在差异，同一嗜水气单胞菌菌株对不同宿主起主要作用的溶血性毒素不同。嗜水气单胞菌引发的许多暴发性病害，多伴有败血症，嗜水气单胞菌溶血性毒素的产生，导致了溶血、败血症状。是否产生溶血素是嗜水气单胞菌是否具有毒力及致病性的重要参考依据之一。嗜水气单胞菌为条件致病菌，产生溶血素的嗜水气单胞菌出现在机体内循环系统中，有时并不能立即致病。在外界环境出现剧烈变化的状况下，一旦机体的免疫力下降达到临界值，该菌产生的溶血毒素会成为暴发疾病的主要因子。该研究结果表明，此次分离的92株嗜水气单胞菌有75%都可产生溶血现象。从江苏地区分离的嗜水气单胞菌，有很高的比例都可以产生溶血素，存在很高的致病风险。这就要求该地区一线养殖管理者，要切实做好池塘管理工作，通过提高环境质量、培育健壮鱼种、投喂免疫增强剂等措施，提高养殖水产品的个体抗性。

参考文献

[1] THAYUMANAVAN T，VIVEKANANDHAN G，SAVITHAMANI K，et al.Incidence of haemolysinpositive and drugresistant Aeromonas hydrophila in freshly caught finfish and prawn collected from major commercial fishes of coastal South India[J].FEMS Immunol Med Microbiol，2003，36（1/2）：41-45.

[2] PARK Y H，LEE H C，SONG H G，et al.Recent increase in antibioticresistant microorganisms in patients with spontaneous bacterial peritonitis adversely affects the clinical outcome in Korea [J].J Gastroenterol Hepatol，2003，18（8）：927-933.

[3] 王玉，冯建军，郭松林，等.嗜水气单胞菌与迟顿爱德华氏菌二联外膜蛋白的表达及其初步免疫原性[J].华中农业大学学报，2015，34（1）：96-102.

[4] CLARK N，CHENOWETH C E.Aeromonas infection of the hepatobiliary system：Report of 15 cases and review of the literature[J].Clin Infect Dis，2003，37（4）：506-513.

[5] 黃艳，韦小瑜，吴成梅，等.一起嗜水气单胞菌引起的食物中毒调查[J].中国食品卫生杂志，2012，24（4）：391-393.

[6] 胡王，蒋启欢，范腾飞，等.鳊鱼出血病嗜水气单胞菌的分离·鉴定与 ERIC-PCR 指纹图谱研究[J].安徽农业科学，2012，40（4）：2056-2057.

[7] 李艳和，杨克礼，潘庭双，等.安徽省斑点叉尾鮰细菌性病原的分离鉴定及药物敏感性分析[J].安徽农业大学学报，2010，37（2）：278-283.

[8] 刘杰，龙宜楠，李大广，等.罗非鱼烂尾病病原菌的分离、鉴定及药敏试验[J].广西畜牧兽医，2014，30（6）：316-319.

[9] 林天龙，陈日升，董传甫，等.欧鳗嗜水气单胞菌的分离、鉴定和特性分析[J].福建农业学报，2001，16（4）：35-40.

[10] 庄健，张治平，曾明华，等.黄鳝出血病病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].长江大学学报（自然科学版），2016，13（3）：23-25.

[11] 刘训猛，黄春贵，邹勇，等.发病牛蛙病原鉴定及防治药物筛选[J].河北渔业，2011（2）：41-44.

[12] 张庆华，马文元，陈彪，等.嗜水气单胞菌引致的金钱鱼细菌性疾病[J].水产学报，2016，40（4）：634-643.

[13] 刘训猛，赵宜清，陈静.我国克氏原螯虾病害及防治技术研究进展[J].中国水产，2013（10）：64-66.

[14] Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：Twentysecond informational supplement [S].Pennsylvania USA：CLSI，2012：44-50.

[15] KO W C，YU K W，LIU C Y，et al.Increasing antibiotic resistance in clinical isolates of Aeromonas strains in Taiwan[J].Antimicrob Agents Chemother，1996，40（5）：1260-1262.

[16] 曲芬，鲍春梅，崔恩博，等.气单胞菌不同种的流行及耐药性[J].中国抗感染化疗杂志，2004，4（5）：302-305.

[17] 龚晖，林天龙，徐长安，等.嗜水气单胞菌气溶素的纯化及其溶血特性分析[J].中国人兽共患病学报，2009，25（5）：422-425.