供钼水平对4株柱花草根瘤菌生长的影响

董荣书　张洁　陈志坚　白昌军　郇恒福　王文强　刘国道

摘 要 为研究不同钼水平对柱花草根瘤菌生长的影响，将4株柱花草根瘤菌接种于不同钼浓度的YMA固体和液体培养基上，通过对根瘤菌生长定性和定量分析，确定不同钼处理对根瘤菌的影响。结果表明：缺钼处理对4株根瘤菌的生长均无显著影响；在钼处理下，4个菌株对钼的耐受能力存在差异，菌株PN13-3的耐钼能力最强，可以耐受的钼浓度为3 000 mg/L，LZ3-2和YM11-1次之，RJS9-2最差，可以耐受的钼浓度为1 500 mg/L；高浓度钼处理使菌株PN13-3、YM11-1（≥2 000 mg/L）和LZ3-2（≥2 500 mg/L）的对数生长期延长，稳定生长期缩短，使菌株RJS9-2（≥500 mg/L）迟缓期延长，对数生长期缩短。

关键词 根瘤菌；钼；生长曲线；柱花草

中图分类号 S541 文献标识码 A

Abstract The effects of different molybdenum（Mo）levels on the growth of four rhizobial strains isolated from Stylosanthes were investigated using the solid yeast mannitol agar（YMA）and liquid YMA medium. The growth of rhizobial strains was evaluated by qualitative and quantitative analysis under different Mo treatments. The results showed that no significant difference was observed among the four tested rhizobial strains without Mo addition. Rhizobial strains exhibited variations in Mo tolerance. The rhizobial strain PN13-3 showed higher Mo tolerance than the other three strains，as reflected by better growth performance under 3 000 mg/L Mo treatment，whereas the growth of RJS9-2 was significantly inhibited by 1 500 mg/L Mo treatment. Furthermore，PN13-3 and YM11-1 with Mo supply above 2 000 mg/L，and LZ3-2 at a Mo concentration greater than 2 500 mg/L exhibited increased the logarithmic growth phase and decreased the stationary phase，while 500 mg/L Mo treatment increased the lag phase and decreased the logarithmic growth phase of RJS9-2.

Key words Rhizobia； molybdenum； growth curve； Stylosanthes

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.004

根瘤菌-寄主共生体系对环境因子的适应能力由寄主、根瘤菌及共生体对环境的适应能力决定[1]，在选择根瘤菌菌剂之前充分了解环境条件及植物、菌株对环境极端因子的耐受能力是保证接种效果的关键。钼不仅是作物生长所必须的微量营养元素，还是固氮酶的重要组成成分，参与根瘤的形成与固氮[2-3]。有研究用钒、钨等元素代替钼，虽然合成了相应的铁蛋白，但是根瘤固氮酶无活性，但在加入钼后立即有固氮酶活性，说明钼在固氮酶中不仅仅起到电子传递的作用，钼还是固氮酶活性中心不可或缺的成分[4]。国内外在钼对根瘤菌影响的研究主要集中于钼对寄主-根瘤菌共生体系的影响，钼的含量直接影响豆科植物结瘤和固氮能力[5]，过高或过低的钼会导致豆科植物的结瘤数下降，有效根瘤数减少，根瘤固氮能力减弱，从而导致植物的氮含量和产量减少[6-7]；研究表明对植物叶片喷施适量的钼肥可以显著提高作物的结瘤量和产量[8-9]，在生产中对菜豆[10]、大豆[11-12]、蚕豆[13]、绿豆[14]等豆科植物增施一定量的钼能显著提高作物的产量。陈俊在钼对大豆根瘤菌影响的研究中表明：钼是根瘤菌生长的必需元素，缺钼时大豆根瘤菌生长缓慢，繁殖扩增受到严重抑制，适量供钼能促进大豆根瘤菌的生长繁殖；而且大豆根瘤菌对钼浓度的适应范围较广，从10 mg/L到1 000 mg/L根瘤菌都能较好地生长，供钼过量会抑制根瘤菌的生长，但不同菌株的耐钼能力不同[15]。国内外尚无钼对柱花草根瘤生长影响的研究，本研究在纯培养下通过不同钼水平的处理研究钼对4株柱花草根瘤菌生长的影响，确定不同菌株生长的最适钼浓度，以期为柱花草根瘤菌的培养和柱花草栽培中钼的施用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 参试菌株

参试菌株为保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所牧草研究中心的4株柱花草高效根瘤菌菌株，分别分离自云南保山、云南元谋、四川攀枝花和广西柳州，菌株RJS9-2 与YM11-1、PN13-3及LZ3-2相比具有较强的耐盐能力，但耐酸能力较差[16]。菌株详细信息如表1。

1.2 方法

1.2.1 不同钼浓度培养基的配制 以YMA培养基为基础培养基[17]，以钼酸铵[（NH4）6Mo7O24·4H2O）]，分析純（含量>99.0%）为钼源，配置不同钼浓度的YMA培养基0.5 L，使培养基最终钼浓度分别为0、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500 mg/L，调节pH值为6.8，分装到50 mL三角瓶中（25 mL/瓶），设3次重复，每个钼浓度增加一瓶100 mL的培养基用于测定OD600值时调零，用封口膜封口，121 ℃灭菌30 min后备用。在各浓度剩余的液体培养基中加入琼脂粉（15 g/L），121 ℃灭菌30 min，待温度降至80 ℃左右倒入培养皿（9 cm）中制备固体培养基，每个浓度3个重复。

1.2.2 菌种活化、接种及培养 将待测菌株从YMA斜面培养基中挑出，活化于YMA固体培养基中，28 ℃培养箱中培养5 d。用灭菌的牙签段（1 cm）挑取菌落分别接种于不同钼浓度的液体培养基中，在180 r/min，28 ℃摇床上培养，计时，在8、16、32、64、128 h时取部分菌液通过分光光度计测定波长为600 nm的吸光值（以相应钼浓度的未接菌培养基调零）。

用接种环挑取各菌株分别接入不同钼浓度固体培养基上，接种前在培养皿底部用记号笔画出最大的内接正方形图案，用对角线划分为4个区域，将4个菌株分别接种到4个区域的培养基上，接种宽度为1 cm，菌株间不能交叉，将接种后的平板放入28 ℃培养箱中培养至无钼处理的培养基上4个菌株都长好后观察各菌株在不同钼浓度培养基上的生长情况，并通过生长最好记“+++”，一般记“++”，生长差记“+”，不生长记“-”的方式统计菌株生长状况（图1）。

1.3 数据分析

试验中所有的数据均用Microsoft Excel 2000、JMP9等统计软件进行统计和方差分析，以Tukey HSD作为差异显著性标准，显著性水平p<0.01。通过JMP9软件对根瘤菌生长数据进行变量代换和回归分析。

2 结果与分析

2.1 不同钼浓度固体培养基对柱花草根瘤菌生长的影响

固体培养可以直观定性的反映菌株生长情况，由图1和表2可知，菌株LZ3-2在钼浓度0～4 000 mg/L的固体培养基上都有菌落，在浓度超过2 500 mg/L的培养基上生长受到抑制，菌落数量减少；菌株YM11-1在钼浓度0～4 000 mg/L的培养基上都能生长，在浓度超过2 000 mg/L的培养基上生长受到抑制，菌落数量减少；菌株RJS9-2在钼浓度为0～3 500 mg/L的培养基上都能生长，在浓度超过1 000 mg/L的培养基上生长受到抑制，菌落数量减少；菌株PN13-3在钼浓度0～4 500 mg/L的培养基上都能生长，在浓度超过3 000 mg/L的培养基上生长受到抑制，菌落数量减少。

2.2 钼处理对柱花草根瘤菌生长曲线的影响

根瘤菌接种到液体培养基后，生长状况可以通过在600 nm的吸光值来反映，通过回归分析可以确定根瘤菌的生长规律及外界条件对生长的影响。图2为4个菌株在不同钼浓度处理下的生长曲线及相应的回归分析。由图2-A可知，菌株YM11-1在钼浓度为0～500 mg/L时，菌液OD600值在0～16 h变化不大，在16～32 h急剧上升，在32～64 h缓慢上升，超过64 h后OD600值开始下降；在钼浓度为1 500～3 000 mg/L时，菌液OD600值在0～16 h变化不大，在16～64 h急剧上升，无平缓增长期，超过64 h后OD600值开始下降；在钼浓度超过3 500 mg/L时，根瘤菌在培养全过程OD600值变化不大。由菌株在各时期的回归方程可知，菌株YM11-1在钼浓度0～2 500 mg/L时，菌株OD600值与培养时间显著相关，相关系数都大于0.80；钼浓度大于3 000 mg/L时菌株OD600值与培养时间相关不显著，且相关系数都小于0.70。

由图2-B可知，菌株PN13-3在钼浓度为0～1 500 mg/L时，菌液OD600值在0～16 h变化不大，在16～32 h急剧上升，在32～64 h缓慢上升，超过64 h后OD600值开始下降；在钼浓度为2 000～3 000 mg/L时，菌液OD600值在0～16 h变化不大，在16～64 h急剧上升，无平缓增长期，超过64 h后OD600值开始下降；在钼浓度超过3 500 mg/L时，根瘤菌在培养全过程OD600值变化不大。由菌株在各时期的回归方程可知，菌株PN13-3在钼浓度0～3 000 mg/L时，菌株OD600值与培养时间显著相关，相关系数都大于0.80；钼浓度大于3 500 mg/L时菌株OD600值与培养时间相关不显著，且相关系数都小于0.50。

由图2-C可知，菌株LZ3-2在钼浓度为0～2 000 mg/L时，菌液OD600值在0～16 h变化不大，在16～32 h急剧上升，在32～64 h缓慢上升，超过64 h后OD600值开始下降；在钼浓度为2 500～3 000 mg/L时，菌液OD600值在0～16 h变化不大，在16～32 h急剧上升，32 h后OD600值仍增加较快，但略慢于16～32 h，超过64 h后OD600值开始下降；在钼浓度超过3 000 mg/L时，根瘤菌在培养全过程OD600值变化不大。由菌株在各时期的回归方程可知，菌株LZ3-2在钼浓度0～2 000 mg/L时，菌株OD600值与培养时间显著相关，相关系数都大于0.93；钼浓度大于2 000 mg/L时菌株OD600值与培养时间相关不显著，且相关系数都小于0.60。

由图2-D可知，菌株RJS9-2在钼浓度为0～1 500 mg/L时，菌液OD600值在8～32 h急剧上升，在32～64 h缓慢上升，超过64 h后OD600值开始下降；在钼浓度为2 000 mg/L时，菌液OD600值在0～16 h变化不大，在16～32 h急剧上升，32 h后OD600值无明显变化，超过64 h后OD600值开始下降；在钼浓度超过2 000 mg/L时，根瘤菌在培养全过程OD600值变化不大。由菌株在各时期的回归方程可知，菌株LZ3-2在钼浓度0～1 500 mg/L时，菌株OD600值与培养时间显著相关，相关系数都大于0.92；钼浓度大于1 500 mg/L时菌株OD600值与培养时间相关不显著，且相关系数都小于0.60。

2.3 4个菌株生长最适钼浓度的确定

根瘤菌稳定期是研究该菌株生长及生理的最佳时期，图3为根据4株根瘤菌在稳定期（64 h）在不同鉬处理的生长状况。由图3可知，缺钼处理对4个根瘤菌菌株的生长无影响，菌株PN13-3在钼浓度为0～3 000 mg/L时生长不受影响，钼浓度超过3 000 mg/L时菌株生长受到严重的抑制，趋于不生长；菌株RJS9-2在钼浓度为0～500 mg/L时生长不受影响，超过500 mg/L时菌株生长受到一定程度的抑制，当钼浓度达2 500 mg/L，菌株生长受到严重的抑制，趋于不生长；菌株LZ3-2和YM11-1在钼浓度为0～1 500 mg/L时生长不受影响，超过1 500 mg/L时菌株生长受到一定程度的抑制，当钼浓度达3 500 mg/L，菌株生长受到严重的抑制，趋于不生长。

3 讨论

根瘤菌抗性试验常通过固体培养基和液体培养基分别从定性和定量2个方面进行确定[16]，固体培养基可以直观地观察菌株的生长及污染状况，液体培养基则可以定量地确定菌液中菌的含量及变化，但液体培养基有污染不易被发现的缺点，故须通过2种培养基相互验证确定钼处理对柱花草根瘤菌生长的影响。本研究中4个柱花草根瘤菌在不同钼水平固体培养基和液体培养基中生长趋势一致，缺钼处理对根瘤菌生长无显著影响，4个菌株对钼的耐受差异较大，菌株PN13-3耐钼能力最强，为3 000 mg/L；菌株LZ3-2、YM11-1耐钼能力次之，为1 500 mg/L；菌株RJS9-2耐钼能力最差仅为500 mg/L。陈俊[15]在研究3株大豆根瘤菌耐钼能力中发现缺钼和高浓度钼处理都会抑制根瘤菌生长，且不同菌株的耐钼能力存在显著差异，高浓度钼抑制根瘤菌生长与本研究结果一致，但缺钼处理结果有较大的差异，研究表明钼主要参与根瘤菌与寄主共生结瘤和固氮过程，并不是根瘤菌纯培养的必须成分[2]，故缺钼处理对根瘤菌生长无影响的结果是合理的，可能是由于菌株类型、培养条件的不同造成的差异。

根瘤菌的生长经历迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期，生长呈“S”型曲线，外界条件的变化对各时期开始和持续时间有显著的影响[18]，从而影响生长对曲线的拟合，故“S”型生长曲线也作为检测菌株生长是否正常的依据，在对4各菌株生长曲线的拟合中发现，生长曲线可以完美的拟合根瘤菌的生长，当钼浓度严重影响根瘤菌生长时，曲线出現相关不显著，因此可以将能否显著的拟合生长曲线来界定根瘤菌的耐钼能力。结合不同钼浓度下固体、液体培养基中4各菌株的耐钼能力的结果，可以确定：RJS9-2的最适钼浓度为1 500 mg/L，LZ3-2的最适钼浓度为2 000 mg/L，菌株YM11-1的最适生长钼浓度为2 500 mg/L，PN13-3的最适钼浓度为3 000 mg/L。

在一定的浓度范围OD600值虽能显著的拟合生长曲线，但随浓度的增加生长曲线不同时期也存在差异，钼处理对根瘤菌各时期的影响分为2种类型，高浓度钼处理使菌株RJS9-2迟缓期延长，对数生长期缩短，使菌株PN13-3、LZ3-2和YM11-1的对数生长期延长，稳定生长期缩短。从分类上看菌株PN13-3、LZ3-2和YM11-1亲缘关系较近，都属于Bradyrhizobium sp.，RJS9-2属于Bradyrhizobium yuanmingense，与3者亲缘关系较远[19]，且菌株RJS9-2虽为慢生根瘤菌，该菌株却具有慢生根瘤菌不具备的特性，比如耐盐性较强，是普通慢生根瘤菌耐盐能力的3倍以上[16]，这些可能是造成生长曲线在钼的影响下存在差异的主要原因。

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