橡胶树1981’IRRDB野生种质苗期初生乳管分化的研究

金华斌　田维敏　史敏晶

摘 要 巴西橡胶树的乳管是产生和贮存天然橡胶的组织。成龄树树干中的次生乳管因与割胶生产直接相关得到了全面的研究，而幼茎、叶初生生长形成的初生乳管因与天然橡胶生产没有直接关系研究相对较少。利用光学显微技术以及Image J统计分析软件，对182份1981IRRDB野生种质苗期的初生乳管分化进行了研究。结果表明，不同种质叶片以及绿色茎皮中的初生乳管分化能力存在明显差异；而同一种质小叶柄和茎皮中的初生乳管分化能力也并不完全一致。在这182份种质中，小叶柄初生乳管面积比例在0.08%～2.6%范围内，但1%以上的种质数量仅占总数的30.8%；在茎皮中，初生乳管面积百分比在1.3%～13.3%范围内，但7.5%以上的种质数量仅占总数的19.2%，可见，野生种质初生乳管分化能力普遍较低。来源于不同州的野生种质乳管分化能力存在明显差异，由强到弱分别是朗多尼亚州（RO/）、阿克里州（AC/）、马托格罗索州（MT/）以及其他非主选区域，其中，朗多尼亚州（RO/）可能更容易筛选到优良的种质。研究结果可为将来种质的引进以及灌木化栽培种质的选育提供依据。

关键词 巴西橡胶树；野生种质；初生乳管；乳管分化；灌木化

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract Laticifers in rubber tree are the sole site for natural rubber biosynthesis and storage. The secondary laticifer in the secondary phloem from trunk has been investigated comprehensively， but the primary laticifer in the tender stem and leaf was studied rarely for no relation with the nature rubber production. By using a light microscopy and Image J Software， the primary laticifer differentiation in the seedling among 182 1981IRRDB wild germplasms was analyzed. The results showed that there was obvious difference of primary laticifer differentiation amongst the germplasms and little consistency between the bark and leaf. The area ratio of primary laticifer in petiolule ranged from 0.08%-2.6%， in which more than 1% area ratio only 30.8% of the total germplasms. In the bark of stem， the area ratio of primary laticifer ranged from 1.3%-13.3%， but more than 7.5% area ratio only 19.2% of the total germplasms. Generally， the capacity of primary laticifer differentiation was low. To compare the germplasms derived from differential states found that， the capacity of primary differentiation had obvious discrepancy among states， from strong to weak was RO/， AC/， MT/， and otherssources，in which RO/ may be the best origin for screening excellent germplasms. The results would provide a basis for the introduction of germplasms and breeding of shrubby cultivation.

Key words Rubber tree； wild germplasm； primary laticifer； laticifer differentiation； shrubby

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.001

橡膠树（Hevea brasiliensis）原产南美亚马孙河流域的热带雨林，属大戟科的多年生乔木，是世界上人工栽培最重要的产胶植物[1]，提供了世界所需大约98%以上的天然橡胶。橡胶树中合成和贮藏天然橡胶的组织是乳管[2-3]，根据乳管的来源和细胞学等特征可以分为初生和次生乳管两大类型[4]。成龄大树的树皮中含有大量次生乳管，在生产中，人们通过割胶即切割树皮中的次生乳管收集排出的胶乳，提炼天然橡胶，次生乳管的多少与天然橡胶产量显著正相关。因此，人们从细胞学、生物化学以及分子生物学等方面对次生乳管的发生、发育以及次生代谢等方面展开了深入的研究[5-9]。橡胶树成熟的种子、叶、花、果实和根以及种子萌发到幼苗长出第一叶蓬的初生生长所形成的各部分器官中的乳管都属于初生乳管[10-11]，初生乳管与天然橡胶生产没有直接的关系，所以研究相对较少。

割胶是橡胶生产中的关键环节，也是当前收获胶乳的唯一方式[12]，割胶对胶工的技术要求很高，但劳动强度大、生产环境条件差（现有技术水平下割胶生产通常是夜间作业），而且劳动报酬低，随着我国劳动力数量进入拐点，胶工短缺和老龄化问题[13]已成为我国天然橡胶产业生存和发展的瓶颈。提高割胶劳动生产率或改变生产模式在现阶段对于发展橡胶产业尤其急迫，机械化采收胶乳是未来的必然趋势[14]。借鉴银胶菊的种植模式，对橡胶树进行灌木化栽培，机械化采收幼茎和叶等组织，提炼初生乳管中的胶乳，对于解决我国当前胶工日益短缺和老龄化是一条值得探索的生产模式，而选出适合灌木化栽培的种质是首要条件。

橡胶树种质资源的分类、保存和遗传分析是橡胶树选育种的重要基础。目前针对次生乳管的产量，我国对橡胶树种质的鉴定和评价已经做了大量的工作[15-19]，但关于初生乳管的产胶能力评价较为缺乏。最早针对初生乳管干胶含量进行的叶脉胶法、小叶柄胶法[20-21]其目的是为了对大树产胶潜力进行早期预测。本研究对182份1981IRRDB野生种质初生乳管分化能力进行初步的鉴定和评价，旨在探明不同野生种质苗期的产胶潜力是否存在差异，为选育适合灌木化栽培的种质提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 于中国热带农业科学院橡胶研究所儋州国家橡胶树种质资源圃选取182份巴西橡胶树不同来源地的1981IRRDB野生种质，其中来自巴西朗多尼亚州（RO/）和阿克里州（AC/）各49份，马托格罗索州（MT/）50份，非主选区域34份（见表1），每份种质选取3株长势良好的植株，每植株中选取一支处于稳定期的萌条，分别采集第一伸长单位的绿色茎皮以及该叶蓬基部健康叶片居中的小叶柄，制备石蜡切片。

1.1.2 主要试剂和仪器 制备石蜡切片所需的乙醇、正丁醇、冰醋酸、二甲苯为国产分析纯，石蜡为生物组织切片专用，光学显微镜为德国Leica DMLB型。

1.2 方法

光学显微切片的制备：材料分割后经80%（V/V）酒精固定24 h，乙醇梯度脱水，碘-溴冰醋酸试剂60 ℃处理36 h，乙醇脱水后经正丁醇透明，石蜡包埋，具体方法参见史自强等[22]并稍作修改。石蜡切片厚度10 μm，二甲苯脱蜡后固绿染色1 h，中性树胶封片，光学显微镜Leica DMLB下观察小叶柄和茎皮横切面标本，并成像。对于小叶柄的材料，统计维管束初生木质部外侧至皮层的区域中初生乳管所占的面积比例。对于茎皮材料，则统计次生韧皮部外侧至初生韧皮纤维带的区域中初生乳管所占的面积比例。

1.3 数据统计分析

利用Image J图形处理软件，每个样品选取3个视野统计乳管面积比值，最后取3个材料的平均值。采用Excel 2003计算并制作图表。

2 结果与分析

2.1 小叶柄初生乳管分化

小叶柄中具有多个维管束，围绕中央部分的髓状组织（基本组织）成圆圈排列。这些维管束由韧皮部、木质部和形成层组成，韧皮部向外侧，木质部靠近中央的髓，而形成层在二者之间。初生乳管呈不规则分布，主要在维管束韧皮部一侧中，极少数分布在皮层和髓状的基本组织中。统计维管束韧皮部一侧中初生乳管所占的面积比例来代表小叶柄中初生乳管的分化能力。

对182份野生种质的统计分析表明，这些野生种质小叶柄中初生乳管的面积比都在3%以内，按照每间隔0.5%的区间划分成6个区段，其中面积比在2.5%～3%区间的的种质仅有1个，为RO/CM/11 63/418（图1-A）；面积比在2%～2.5%的种质有2个，分别为RO/PB/1 2/157和MT/C/7 8/43；面积比在1.5%～2%的种质增多为13个，其他166个种质的面积比例均在1.5%之下。在这166个种质中，面积比为1%～1.5%的种质有40个；面积比在0.5%～1%区段的种质最多，有74个；面积比在0.5%以下的种质仍然有52个，其中最少的是RO/CM/11 63/204，不到0.1%（图1-B）。可见，野生种质中小叶柄初生乳管所占的面积比例总体偏低（图1-C），表明乳管分化能力高的种质较少。

2.2 茎皮中初生乳管分化

幼茎进行初生生长形成的乳管都是初生乳管。初生乳管紧靠次生韧皮部的外方分布，看起来像是初生韧皮部的一部分，但其发生与初生韧皮部没有联系[10]。初生乳管排列不规则，统计数目困难，所以统计了从次生韧皮部的外侧到初生韧皮纤维带之间的初生乳管所占的面积比例。结果表明，野生种质的茎皮中初生乳管面积比最高为13.3%，代表种质为RO/CM/11 63/361（圖2-A），面积比例最低的为1.3%，代表种质为7/02/81 1/7（图2-B）。由于面积比例10%以上的种质较少，仅有5个，则划归为一个区段；10%以内的种质有177个，则按照每间隔2.5%划分为4个区段，其中面积比为7.5%～10%的种质有30个；面积比为5%～7.5%的种质有81个，属于种质最多的区段；面积比为2.5%～5%的种质有62个；而面积比小于2.5%的种质仅有4个。可见，在茎皮中，面积比例高的种质也较少（图2-C）。由于橡胶树萌条中茎皮所占据的生物量远小于叶，所以后续比较分析中主要以代表叶乳管分化能力的小叶柄的数据进行。

2.3 茎皮和小叶柄中初生乳管分化能力的比较

对同一种质中茎皮和小叶柄两个不同的部位的初生乳管分化能力进行比较分析，结果表明，二者之间没有明显的对应关系。种质RO/CM/11 63/361在茎皮中初生乳管的面积比例最大，为13.3%，但小叶柄中只有0.8%，低于野生种质中的平均水平（图3-A，B）； MT/C/7 8/43茎皮中仅有3.8%，远低于平均水平；但小叶柄中初生乳管的面积比例高达2.2%（图3-C，D）。小叶柄和茎皮中初生乳管分化能力都较强的种质是灌木化栽培的首选，但在这182份野生种质中未能直接筛选到这种类型的种质。

2.4 巴西橡胶树不同州野生种质叶片中初生乳管分化能力差异分析

1981IRRDB野生种质引自巴西亚马孙河流域不同的州，对这些来自不同区域的野生种质小叶柄初生乳管分化能力进行比较分析，结果表明，选自巴西朗多尼亚州（RO/）初生乳管分化能力强的野生种质数量最多，其中乳管面积比在1%以上的种质占该州的55.1%，并且有2个种质的乳管所占面积比达到2%以上，而低于0.5%面积比例的种质很少，仅约10%（图4-A）；阿克里州（AC/）其次，乳管面积比值在1%以上的种质占该州的38.7%，但低于0.5%面积比例的种质数量也增多至该州的22.5%（图4-B）；来自马托格罗索州（MT/）的野生种质初生乳管分化能力普遍较差，虽然有少数种质有良好表现，面积比例在1.5%以上的种质有6个，占该州50份种质中的12%，但面积比例在1%～1.5%的种质仅1份，占2%，而面积比0.5%～1%区段的种质有23个，占46%；0.5%以下区段的有20个，占40%（图4-C）；对于来自其他非主选区域的野生种质初生乳管分化能力最弱，没有面积比例1.5%以上的种质，1%～1.5%也仅有3个种质，占所选34份种质中的8.8%，余下种质面积比皆在1%以下（图4-D）。由此可见，来自不同地域的种质乳管分化能力存在差异，朗多尼亚州（RO/）可能更容易筛选到优良的种质，这些结果为以后种质的引进以及筛选提供参考。

3 討论

巴西橡胶树大树树干中的次生乳管是产排胶的主要组织，可再生的产排胶特性决定了其采胶方式是进行有规划的切割树皮。次生乳管的数量、两次割胶之间的胶乳再生能力以及排胶时间是限制天然橡胶产量的3个主要因子[11-23]。目前的割胶生产只与次生乳管相关，所以长期以来，我国选育种工作主要是针对次生乳管的各种特征进行[24]。除次生乳管外，橡胶树的嫩枝、叶中含有另一种类型的乳管，即初生乳管，其中同样含有大量的胶乳，但因与采收没有直接关系，所以对其研究较少，针对初生乳管产胶潜力的选育种则未见报道。鉴于我国当前天然橡胶自给率严重不足，胶工老龄化、短缺等产业发展现状[25]，天然橡胶产业急需结构性改革。对巴西橡胶树进行灌木化栽培，借鉴银胶菊[26]实现机械化采胶，可能是未来的一个可行的生产模式，筛选适合这种模式的种质是首要条件。

1981IRRDB野生种质引自巴西亚马孙河流域，是较魏克汉种质晚期引进的种质，具有更为广泛的遗传基础[18-19， 27]，对该种质的主要性状进行鉴定、评价是选育种的重要基础。基于灌木化栽培的目的，选育种的主要目标不再是次生乳管而是茎、叶中的初生乳管。由于叶片的生物量远大于茎皮，我们对于苗期乳管分化的研究主要着眼于叶，同时考虑茎皮。小叶柄中的乳管因与叶片和大叶柄中的相连，通常被认为是能稳定代表叶片乳管分化情况的部位，但已有的小叶柄中初生乳管的统计是以个数来进行的[20， 28-29]，而初生乳管在排列上不规则，且乳管之间有接合管相连[10]，统计个数存在不准确的问题。另外，初生乳管的大小也存在差异，仅以个数很难代表初生乳管的产胶潜力。本文中借助Image J图形处理软件，能很好的统计切片中不规则图形的面积。小叶柄中在皮层的基本组织、维管束及居中的假髓的基本组织中都可能有初生乳管[28]，但主要分布在维管束中并最为稳定，本文中首次通过统计小叶柄中初生乳管占据维管束木质部外侧的面积比作为乳管分化能力的指标，对182份1981IRRDB野生种质的初生乳管分化进行了研究，能更准确地反应不同种质苗期的乳管分化能力和产胶潜力。

本研究表明，小叶柄和茎皮中的初生乳管分化在不同的种质中存在明显的差异。虽然幼嫩茎皮和叶片中最初分化的初生乳管存在相连的情况[10]，但我们观察到在这两个部位中的初生乳管分化能力并不完全一致。RO/CM/11 63/361在茎皮中初生乳管的面积比例最大，但小叶柄中低于野生种质中的平均水平；MT/C/7 8/43小叶柄中初生乳管面积比例接近最高值为2.2%，但茎皮中仅有3.8%，远低于平均水平。在本研究的182份种质中未检测到茎皮和叶两个部位乳管分化能力都强的种质，供给商品化生产栽培的品种可能还需要进一步的选育。

1981IRRDB野生种质主要来自朗多尼亚州（RO/）、阿克里州（AC/）和马托格罗索州（MT/）三大州。本研究中对来自三大州的种质分别选了近50份，从其他非主选区选择了34份种质进行区域对比。结果表明来自不同地域的种质乳管分化能力存在差异，朗多尼亚州（RO/）乳管面积比例高的种质更多，可能更容易选育到优良的种质，同时该州中具有乳管分化能力最高和最低这两种极端的种质，表明其种质的遗传背景更富于多样性。

本文从初生乳管分化能力的角度对来自不同区域的野生种质初步进行了鉴定和评价，为以后种质的引进、筛选及适合灌木化栽培种质的选育提供参考。

致谢 本研究所用橡胶树种质由国家农作物种质资源平台-国家橡胶树种质资源子平台提供，胡彦师副研究员在野生种质识别上提供了专业支持。

参考文献

[1] Yeang H Y， Arif S M， Yusof F， et al. Allergenic proteins of natural rubber latex[J]. Methods， 2002， 27： 32-45.

[2] dAuzac J， Prevot J C， Jacob J L. Whats new about lutoids？ A vacuolar system model from Hevea latex[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 1995， 33（6）： 765-777.

[3] Kongsawadworakul P， Viboonjun U， Romruensukharom P， et al. The leaf， inner bark and latex cyanide potential of Hevea brasiliensis： Evidence for involvement of cyanogenic glucosides in rubber yield[J]. Phytochemistry， 2009， 70： 730-739.

[4] Gomez J B. Comparative ultracytology of young and mature latex vessels in Hevea brasiliensis[C] // Rubber Research Institute Malaysia， Proceeding of the International Rubber Conference.1975， Kuala Lumpur， 1976： 143-164.

[5] dAuzac J， Jacob J L， Chrestin H. The Laticiferous cell and latex-A model of cytoplasm[C] // Physiology of Rubber Tree Latex. Boca Raton： CRC Press， 1989： 59-98.

[6] Hao B Z， Wu J L. Laticifer differentiation in Hevea brasiliensis： induction by exogenous jasmonic acid and linolenic acid[J]. Annals of Botany， 2000， 85： 37-43

[7] Wu S H， Zhang S X， Chao J Q， et al. Transcriptome analysis of the signalling networks in coronatine induced secondary laticifer differentiation from vascular cambia in rubber trees[J]. Scientific Reports， 2016， 6： 36384. doi： 10.1038/srep36384.

[8] 田维敏， 史敏晶， 谭海燕， 等. 橡胶树树皮结构与发育[M]. 北京： 科学出版社， 2015.

[9] 孙 强. 巴西橡胶树有节乳管组织发育的研究[J]. 厦门大学学报（自然科学版）， 1997， 36（6）： 935-941.

[10] 吴继林， 谭海燕， 曾日中， 等. 巴西橡胶树初生乳管分化与苗生长的关系[J]. 热带作物学报， 2000， 21（4）： 1-6.

[11] Gomez J B. Anatomy of Hevea and its influence on latex production[Z]. Kuala Lumper： Malaysia Rubber Research and Development Board， Monograph No.7， Rubber Research Institute Malaysia， Kuala Lumpur， 1982.

[12] 魏小弟.我国割胶生产技术现状和建议[J]. 中国热带农业， 2010（33）： 5-6.

[13] 钟 勇. 海南橡胶种植业发展前景分析[J]. 热带农业科学，2016， 36（8）： 69-75

[14] 高宏华， 黄云生， 校现周， 等. 浅议机械化采割的紧迫性和可行性[J]. 中国热带农业， 2015（65）： 10-13.

[15] 钟淦彬， 李维国， 吴春太，等. 188份巴西橡胶树种质材料AFLP 指纹图谱分析[J]. 热带作物学报， 2013， 34（1）： 1-9.

[16] 刘松泉.巴西橡胶的生产形势和选育种工作[J]. 云南热作科技，1989， 12（3）： 1-8.

[17] 冯素萍， 李维国， 于 飞， 等. 巴西橡胶树SSR遗传图谱的构建[J]. 遗传， 2010， 32（8）： 857-863.

[18] 曾 霞， 胡彦师， 方家林， 等. 橡胶树 1981IRRDB野生种质主要性状鉴定—1986-1994年大田鉴定区[J]. 植物遗传资源学报， 2007， 8（1）： 35-40.

[19] 龙翔宇， 何 斌，王 闯， 等. 橡胶树1981IRRDB 野生种质及栽培品系ITS序列多态性及其进化分析[J]. 热带作物学报， 2015， 36（12）： 2 113-2 119

[20] 郭祁源， 周钟毓， 詹赛荣， 等. 巴西橡胶树苗期产量测预方法第二次验证报告（1982～1994）[J]. 热带作物研究， 1995（2）：9-13.

[21] 周钟毓， 袁燮辉， 郭祁源， 等. 巴西橡胶树产量苗期测预方法及其理论依据的研究[J]. 热带作物学报， 1982， 3（2）： 1-16.

[22] 史自强， 胡正海. 植物含胶组织的制片方法[J]. 植物学报，1965， 13（2）： 179-182.

[23] Hao B Z， Wu J L. Biology of laticifers in Hevea and latex production[J]. 热带作物学报， 2004， 25（4）： 1-7.

[24] 黄华孙. 中国橡胶树育种五十年[M]. 北京： 中国农业出版社， 2005.

[25] 陈明文. 我国天然橡胶产业发展形势与因应策略[J]. 农业经济问题， 2016（10）： 91-94.

[26] 庞廷祥， 程儒雄， 伦华文， 等. 银胶菊引种试种研究报告[J]. 热带农业科学， 2007， 27（1）： 1-11

[27] 周钟毓. IRRDB非洲三叶橡胶种质中心1981年种质收集情况[J]. 热带作物译丛， 1987（2）： 1-5

[28] 周钟毓， 黄 香， 詹赛荣， 等. 橡胶树乳管系与产量早期预测关系的研究[J]. 热带作物学报， 1984， 5（1）： 29-36.

[29] 黃 香， 韦礼贞， 詹赛荣， 等. 橡胶苗期叶部乳管系与-产量早期预测关系的初步研究[J]. 热带作物学报， 1981， 2（1）： 16-20.