一株产壳聚糖酶菌株的培养条件优化

赵玉巧 徐娜 杜云建

摘要[目的] 优化产壳聚糖酶菌株的培养条件。[方法] 对一株从海洋中筛选的假单胞菌XK-3菌株产壳聚糖酶条件进行优化。[结果]培养基最佳组成：葡萄糖30.0 g/L，牛肉膏为15.0 g/L，（NH4）2SO4 15.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。摇瓶培养最佳条件：培养初始pH 6.0，培养温度28 ℃，装液量20%。Mg2+、Ca2+ 、Mn2+对壳聚糖酶活力有一定的促进作用，Fe3+、Cu2+和Zn2+对壳聚糖酶活力有一定的抑制作用。摇瓶培养条件优化后得到的壳聚糖酶活力为3 430 U/L，优化前壳聚糖酶活力为1 072 U/L，优化后是优化前的3.2倍。摇瓶培养得到菌体的最适生长时间为24 h，发酵于64 h后结束。[结论] 优化后的培养条件提高了壳聚糖酶产量，使该菌株的工业应用成为可能。

关键词壳聚糖酶；假单胞菌；培养基；优化

中图分类号S18文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）08-0007-03

Optimization of Culture Conditions of the Strain that Produced Chitosanase

ZHAO Yuqiao， XU Na， DU Yunjian

（Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology， Huaihai Institute of Technology， Lianyungang，Jiangsu 222005）

Abstract[Objective] To optimize culture conditions of the strain that produced chitosanase. [Method]The culture conditions of Rhodotorula sp.strain were optimized for the production of trehalose. [Result]The optimum medium consisted of 30.0 g/L sucrose， 15.0 g/L beef extract， 15.0 g/L（NH4）2SO4，2.0 g/L K2HPO4，2.0 g/L KH2PO4 ，5.0 g/L NaCl ，0.5 g/L MgSO4·7H2O . The optimum culture conditions were determined as follows： initial pH 6， temperature 28 ℃，fluid volume 20%.Mg2+， Ca2+ and Mn2+ had a certain promoting effect on the activity of enzyme， Fe3+， Cu2+ and Zn2+ had a certain inhibitory effect on the activity of the enzyme. The yield of the chitosan enzyme was 3 430 U/L through optimized shaking flask culture conditions， the yield of chitosan enzyme was 1 072 U/L before optimization， the optimized result was 3.2 times of that of the former.The optimum growth time was 24 h， and the fermentation time was 64 h. [Conclusion] The culture conditions that were optimized improve the chitosan enzyme production， and make the industrial application of the strains possible.

Key wordsChitosanase；Pseudomonas sp.；Medium；Optimization

殼聚糖是由D-氨基葡萄糖通过β-1，4-氨基糖苷键连接而成[1]，其基本不溶于水，影响了其应用范围。壳聚糖酶可使壳聚糖水解为不同分子量的水解物，这些水解物大多数水溶性好，从而使其广泛应用。Harish Prashanth等[2]研究发现，壳寡糖能抑制肿瘤血管生成并促进癌细胞凋亡。

壳聚糖酶主要来自于细菌、放线菌、真菌等生物群中[3]，由于一般的壳聚糖酶产生菌产酶活力都较低，为了得到活力较高的壳聚糖酶，需要对产壳聚糖酶菌株发酵条件进行优化。涂绍勇等[4]对从土样中分离到的一株产壳聚糖酶菌株的产酶条件进行了优化，发酵液中酶活力可达2.16 U/mL。孙菲等[5]对从土样中分离到的JH01菌株进行产酶条件优化，发酵液中壳聚糖酶活力可达26.03 U/mL。笔者对一株从海洋中筛选的假单胞菌XK-3菌株进行培养条件优化，以提高壳聚糖酶的产量，使该菌株的工业应用成为可能。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种。从海水中筛选的假单胞菌。

1.1.2培养基。①斜面培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0～20.0 g，补煮沸过滤陈海水至1 000 mL，pH 7.0～7.2。②种子培养基：葡萄糖5.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，K2HPO4 2.0 g，KH2PO4 2.0 g，NaCl 5.0 g，Mg SO4·7H2O 0.5 g，补煮沸过滤陈海水至1 000 mL，pH 7.0。③ 基础培养基：粉末壳聚糖10.0 g，葡萄糖1.0 g，硫酸铵5.0 g，酵母提取物3.0 g，K2HPO4 2.0 g，KH2PO4 2.0 g，NaCl 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，补煮沸过滤陈海水至1 000 mL，pH 6.5。

种子培养条件：250 mL三角瓶装75 mL培养基，摇床转速150 r/min，28 ℃培养12 h。摇瓶培养条件：接种量2%，培养时间72 h，其余条件与种子培养相同。

1.2方法

1.2.1培养基优化。①碳源的选择。碳源为淀粉、糊精、壳聚糖水解物（分子量50 000）、葡萄糖、壳寡糖、胶体壳聚糖、羧甲基纤维素钠，加入量均为10 g/L，其他成分及条件相同。②氮源的选择。以葡萄糖作为碳源，氮源为酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、硝酸钾、尿素、豆饼粉，浓度均为8 g/L，其他成分及条件都相同。③碳氮比的选择。以葡萄糖为碳源，牛肉膏和硫酸铵为氮源，2种氮源的比例为1∶1，采用的碳氮比例及加入量分别为2∶1（10∶5、20∶10、30∶15）、1∶1（10∶10、20∶20、30∶30）、1∶2（5∶10、10∶20、15∶30）及1∶3（5∶15、7.5∶22.5、10∶30） （括号中为碳、氮源的加入量之比，单位为 g/L），其他成分及条件相同。④金属离子对壳聚糖酶合成的影响。选择Mn2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+共6种离子，其盐加入量均为0.5 g/L，用2.5%的氯化钠溶于蒸馏水替代海水。

1.2.2培养条件优化。①初始 pH。采用优化后的最佳培养基，初始pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，其他培养条件：培养温度28 ℃，装液量为250 mL三角瓶装75 mL培养基，培养时间72 h。② 培养温度：培养温度选择25、28、30、32、35 ℃，初始pH 6.0，其余条件同 ①。③ 装液量。在250 mL三角瓶中装液量分别选择37.5（15%）、50.0（20%）、62.5（25%）、75.0（30%）、87.5（35%）、100.0 mL（40%），培养温度28 ℃，其余条件同②。④ 菌体生长及壳聚糖酶产生过程。在250 mL三角瓶装50 mL培养基，培养温度28 ℃，pH 6.0，培养时间84 h，考察细胞生长量和壳聚糖酶产量，以此来考察参数之间的关联。

1.3测定项目与方法采用细胞干重法测定细胞生长量；采用DNS显色法测定壳聚糖酶活力[6]。

2结果与分析

2.1碳源对壳聚糖酶活力的影响

由图1可知，菌株利用分子量大的多糖产酶能力低。以葡萄糖为碳源有利于该菌株产酶，菌体产酶活力最高，达1 253 U/L，糊精和壳寡糖次之，故选择葡萄糖作为碳源。

2.2氮源对壳聚糖酶活力的影响

由图2可知，在含有尿素的发酵液中，该菌株的产酶能力最低，仅679 U/L；采用牛肉膏和硫酸铵作为氮源，菌株的产酶活力分别为2 104和2 029 U/L，故选择牛肉膏和硫酸铵作为氮源。

2.3碳氮比对壳聚糖酶活力的影响

由表1可知，当培养基中碳氮比为1∶1时，壳聚糖酶活力最高，且碳氮源的加入量越高其酶活力也越高，当碳源与氮源加入量均为30.0 g/ L时，酶活力达3 960 U/L，即葡萄糖加入量为30.0 g/ L，牛肉膏和硫酸铵加入量均为15.0 g/ L。

2.4无机离子对壳聚糖酶活力的影响

由图3可知，不同离子对壳聚糖酶的影响不同，Mg2+、Ca2+ 、Mn2+对菌株产酶有明显促进作用，加入Mg2+菌株所产壳聚糖酶活力达3 744 U/L，Ca2+、Mn2+对酶活力也有一定的促进作用，而Fe3+、Cu2+和Zn2+对壳聚糖酶活力有一定的抑制作用。

2.5初始pH对壳聚糖酶活力的影响

由图4可知，当pH小于6.0时培养基初始pH對酶活力的影响较大；pH在5.0～6.0时酶活力呈上升趋势；当pH 6.0～7.5时，酶活力呈下降趋势；pH为6.0时酶活力最高，为3 848 U/L。故选择培养基最佳初始pH为6.0。

2.6装液量对壳聚糖酶活力的影响

由图5可知，装液量对假单胞菌XK-3菌株产壳聚糖酶有一定的影响，20%的装液量（250 mL三角瓶装液量为50 mL）酶活力最高，达3 076 U/L。随着装液量的增加，壳聚糖酶活力逐渐下降。因此，确定最佳装液量为20%（250 mL三角瓶装液量为50 mL）。

2.7培养温度对壳聚糖酶活力的影响

由图6可知，假单胞菌XK-3菌株在25～28 ℃培养时，酶活力增长较快，培养温度为28 ℃时，发酵液中酶活力最高，达3 704 U/L。温度高于28 ℃时，发酵液中酶活力下降较快，30～35 ℃时，酶活力下降缓慢。菌株XK-3产酶温度较低与菌株来自于海洋有一定关系。

2.8菌株XK-3的生长及产酶情况

由图7可知，0～32 h菌体生长速度较快，32 h后生长趋于平缓。酶活力呈逐渐增长的

倍。该菌株产酶量逐渐增加可能与所产酶为胞外酶有关，虽然菌体生长量在34 h后已不再增加，但胞内的酶逐渐透出细胞及细胞的自溶仍逐渐增加。结合菌株XK-3的生长及产酶曲线，确定培养结束时间为64 h。

3结论与讨论

该研究结果表明，菌株XK-3摇瓶培养最佳培养基：葡萄糖30.0 g/L，牛肉膏15.0 g/L，（NH4）2SO4 15.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。当培养基中碳氮比为1∶1时，壳聚糖酶活力最高，且碳氮源的加入量越高其酶活力也越高，但碳氮源含量过高会使原料利用率降低，并对环境造成污染， 故生产中可采取中间补料的方法。Ca2+ 、Mg2+ 和Mn2+对酶活力有一定的促进作用，而Cu2+、Fe3+和Zn2+对壳聚糖酶活力有一定的抑制作用，其他离子对酶活力无明显作用，而海水中Fe3+、Cu2+和Zn2+含量很低，说明用海水配制培养基对该菌株的产酶量无影响。

该菌株壳聚糖酶的产生均对初始pH、溶氧及培养温度敏感，特别是培养温度，低于或高于28 ℃酶活力均明显下降，这就要求生产过程中对温度的控制要尽量准确。

45卷8期赵玉巧等一株产壳聚糖酶菌株的培养条件优化

参考文献

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[2] HARISH PRASHANTH K V，THARANATHAN R N.Depolymerized products of chitosan as potent inhibitors of tumorinduced angiogenesis[J].Biochip Biophys Acta，2005，1722（1）：22-29.

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[4] 涂绍勇，杨爱华，吴柏春，等.产壳聚糖酶菌株的筛选及其发酵产酶条件的研究[J].化学与生物工程，2009，26（9）：52-55.

[5] 孙菲，陈山岭，李宜海，等.壳聚糖酶高产菌株的筛选、产酶条件的优化及壳聚糖酶的分离纯化[J].现代食品科技，2006，22（3）：21-27.

[6] 曾嘉，郑连英.通过酶促反应制备壳寡糖[J].食品与发酵工业，2001，27（10）：1-4.